載紫杉醇聚乙二醇修飾的大黃酸偶聯物膠束制劑穩定性研究

陸偉利，王夏英，許雪雅，鄭雅玲，徐 偉，王曉穎

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一種天然的二萜類化合物，臨床上常用于治療惡性腫瘤。但由于PTX水溶性極低，這嚴重限制了PTX的臨床使用，國內外研究者分別從化學改構、物理引導、改進制劑技術等不同角度來解決這個問題。近年來，研發具有靶向特異性的PTX新型釋藥系統成為了國內外廣泛關注的熱點。

近年來納米材料在癌癥診斷和治療中得到了廣泛應用［1-4］。聚合物膠束（polymeric micelles，PMs）由兩親性聚合物組成，能夠在水性環境中自組裝成粒徑較小的納米結構［5-7］，具有疏水性內核和親水性外殼，能提高難溶性藥物的水溶性［8-10］。PMs作為納米級給藥系統具有：①提高難溶性藥物的溶解度和穩定性；②可生物降解和低毒性；③可延長藥物在體內循環時間，增強滲透滯留效應等特性［5，11］。

本課題組前期合成了一種能在水中自組裝成聚合物膠束的兩親性聚已二醇（PEG）修飾的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯物（CRmP偶聯物）［12］。以CRmP偶聯物為載體，紫杉醇（PTX）為模型藥物進行物理包載，制備得到載PTX的CRmP膠束（PTX/CRmP膠束）。凍干技術能夠將水以固態的形式直接升華去除，具有保持物質活性、防止其被氧化和加水易復原等優勢，廣泛用于保存蛋白質、血清和細胞等生物物質［13-14］，并且可用于改善納米載體例如脂質體等的穩定性［15］。然而，凍干過程的極端環境可能會對聚合物納米膠束的狀態造成破壞，因此，需要添加凍干保護劑進行保護。本研究旨在優選PTX/CRmP膠束凍干制劑的最佳凍干保護劑，同時探討在添加最佳凍干保護劑的PTX/CRmP膠束凍干制劑與臨床常用輸液配伍后以及在高溫、高濕及長期貯存的條件下的穩定性，為該制劑的臨床安全應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 試劑與材料 CRmP偶聯物（自制）；PTX/CRmP膠束（自制）；紫杉醇（上海中西三維藥業有限公司，批號：201801004）；MWCO14000透析袋（上海綠鳥科技發展有限公司）；甲醇（色譜純）、葡萄糖（分析純）、蔗糖（分析純）、甘露醇（分析純）均購于國藥集團化學試劑有限公司；乳糖（分析純，天津永大化學試劑公司）。

1.2 儀器 JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ALPHA1-2 LD plus冷凍干燥機（德國Christ公司）；NICOMPTM 380ZLS激光粒徑測定儀（美國Santa Bbarbara公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本株式會社島津制作所）。

2 方 法

2.1 PTX/CRmP膠束凍干制劑的制備 采用透析法［12］制備的PTX/CRmP膠束溶液分別加入一定量的葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖作為凍干保護劑，溶解混合均勻，分別得到含0.1%、0.2%、0.4%的葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖12種凍干保護劑的混合溶液，按1 mL/瓶分裝，每種溶液制備3份，-20℃冰箱預凍24 h后，冷凍干燥即得。

2.2 PTX/CRmP膠束最佳凍干保護劑的篩選 凍干后觀察凍干制劑的外觀；稱取一定量的凍干制劑加入超純水配制成2 mg/mL溶液，每種溶液制備3份，觀察其復溶性；以1 mg/mL濃度加入粒徑儀中4 mL標準樣品池（1 cm×4 cm，石英玻璃），設定測量時間為3 min，即可測得溶液中膠束粒徑平均值及溶液體系的多分散系數（PDI）；載藥量及包封率的測定及計算方法參見文獻［12］。分別以PTX/CRmP膠束凍干制劑的外觀、復溶性、粒徑、PDI、載藥量及包封率為指標，考察12種凍干保護劑對PTX/CRmP膠束凍干制劑的保護效果，并優選出最佳凍干保護劑。

2.3 PTX/CRmP膠束凍干制劑穩定性試驗

2.3.1 與常用輸液配伍 以0.2%甘露醇作為最佳凍干保護劑，根據“2.1”項下制備PTX/CRmP膠束凍干制劑。取該凍干制劑若干分別采用注射用水、0.9%氯化鈉溶液、5%葡萄糖溶液溶解稀釋至濃度為2 mg/mL，置于室溫（25℃）下24 h，分別于0、4、8、12、24 h取樣測定其粒徑及PDI。

2.3.2 高溫試驗 以0.2%甘露醇作為最佳凍干保護劑，根據“2.1”項下制備PTX/CRmP膠束凍干制劑。稱取該凍干制劑置于西林瓶中，在60℃條件下放置10 d，分別在第5天和第10天取樣，觀察樣品的外觀，加水配制成1 mg/mL溶液后測定其載藥量、包封率、粒徑、PDI及電位。

2.3.3 高濕試驗 以0.2%甘露醇作為最佳凍干保護劑，根據“2.1”項下制備PTX/CRmP膠束凍干制劑。稱取該凍干制劑置于西林瓶中，放置于溫度為25℃，相對濕度為（90±5）%的試驗箱中10 d，分別在第5天和第10天取樣，觀察樣品的外觀，計算吸濕增重，加水配制成1 mg/mL溶液后測定其載藥量、包封率、粒徑、PDI及電位。

2.3.4 長期儲存試驗 以0.2%甘露醇作為最佳凍干保護劑，根據“2.1”項下制備PTX/CRmP膠束凍干制劑。稱取該凍干制劑置于西林瓶中，置于室溫25℃下3個月，并分別于第0、1、3個月取樣，觀察樣品的外觀，加水配制成1 mg/mL溶液后測定其載藥量、包封率、粒徑及PDI、電位。

3 結 果

3.1 PTX/CRmP膠束最佳凍干保護劑的篩選 加入不同凍干保護劑的PTX/CRmP膠束凍干制劑的外觀狀態和復溶性比較見表1。結果顯示以0.2%甘露醇作為凍干保護劑的PTX/CRmP膠束凍干制劑呈黃色棉絮狀，表面完整，無塌陷皺縮，質地疏松，用刮刀輕刮不黏附于刮刀上，加入適量溶劑復溶后輕搖即可形成均一黃色透明的溶液。添加不同凍干保護劑的PTX/CRmP膠束凍干制劑的載藥量、包封率、粒徑及PDI比較見表2。結果顯示以0.2%甘露醇作為凍干保護劑的PTX/CRmP膠束凍干制劑具有較高的載藥量和包封率及較小的粒徑。因此，選用0.2%甘露醇作為PTX/CRmP膠束凍干制劑的最佳凍干保護劑。

表2 添加不同凍干保護劑的PTX/CRmP膠束凍干制劑的載藥量、包封率、粒徑及PDI比較（±s）

表2 添加不同凍干保護劑的PTX/CRmP膠束凍干制劑的載藥量、包封率、粒徑及PDI比較（±s）

保護劑無保護劑0.1%葡萄糖0.2%葡萄糖0.4%葡萄糖0.1%甘露醇0.2%甘露醇0.4%甘露醇0.1%蔗糖0.2%蔗糖0.4%蔗糖0.1%乳糖0.2%乳糖0.4%乳糖n3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3載藥量/%38.25±3.38 39.19±2.98 39.57±2.75 40.57±0.87 39.06±1.68 40.19±1.06 39.32±0.60 36.17±0.75 38.96±0.45 36.09±2.24 38.82±3.79 40.50±0.74 38.92±1.19包封率/%70.31±6.21 72.04±5.48 72.74±5.05 74.58±1.60 71.80±3.10 73.87±1.94 72.28±1.10 66.49±1.37 71.62±0.83 66.33±4.12 71.36±6.97 74.45±1.36 71.53±2.19粒徑/nm 203.6±4.50 221.6±12.4 209.3±2.8 218.0±10.0 205.4±2.2 197.4±2.0 200.0±3.0 204.8±8.2 202.4±5.2 201.9±0.1 211.1±2.1 209.0±7.3 211.8±4.6 PDI 0.137±0.026 0.162±0.011 0.153±0.054 0.181±0.046 0.120±0.030 0.196±0.034 0.173±0.037 0.165±0.029 0.183±0.040 0.182±0.058 0.124±0.014 0.163±0.039 0.133±0.034

3.2 PTX/CRmP膠束凍干制劑穩定性

3.2.1 與常用輸液配伍 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑與注射用水、0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液配伍后24 h內穩定性指標比較見圖1。結果表明該凍干制劑用5%葡萄糖注射液配伍后粒徑均無明顯變化，但用0.9%氯化鈉注射液配伍后粒徑均減小，且PDI隨著時間的延長有減小的趨勢，故選用0.9%氯化鈉注射液作為最佳配伍溶劑。

圖1 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑與常用輸液配伍穩定性試驗

3.2.2 高溫、高濕試驗 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑在高溫、高濕條件下的穩定性指標比較見表3和表4。結果表明在高溫、高濕條件下，該凍干制劑的外觀均無明顯變化，始終呈黃色飽滿絮狀，且在第5天和第10天取樣測定的載藥量、包封率、粒徑、PDI、電位等均無明顯變化，在高濕條件下吸濕增重低于5%，表明該凍干制劑具有較好的穩定性。

表3 高溫條件下添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑穩定性試驗（±s）

表3 高溫條件下添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑穩定性試驗（±s）

時間第0天第5天第10天外觀黃色飽滿絮狀黃色飽滿絮狀黃色飽滿絮狀載藥量/%35.50±1.01 38.64±4.30 32.26±5.28包封率/%63.62±2.97 68.99±6.78 59.27±5.95粒徑/nm 205.7±4.4 211.2±23.9 190.8±15.3 PDI 0.119±0.022 0.132±0.014 0.154±0.034電位/mV-27.15±2.2-29.74±1-31.48±0.86

表4 高濕條件下添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑穩定性試驗（±s）

表4 高濕條件下添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑穩定性試驗（±s）

時間第0天第5天第10天外觀黃色飽滿絮狀黃色飽滿絮狀黃色飽滿絮狀載藥量/%36.10±1.25 35.24±6.20 36.92±3.82包封率/%67.12±1.07 65.10±5.18 66.65±4.05粒徑/nm 198.2±10.5 201.4±13.7 210.3±21.9 PDI 0.141±0.015 0.127±0.021 0.149±0.029電位/mV-29.36±3.9-30.56±1.7-32.70±0.51

3.2.3 長期儲存試驗 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑在室溫條件下，儲存0、1、3個月后穩定性指標比較見表5。結果表明隨著儲存時間的延長，該凍干制劑復溶后的各項穩定性指標均無明顯變化，表明該凍干制劑長期儲存穩定性良好。

表5 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑長期儲存的穩定性試驗（±s）

表5 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP膠束凍干制劑長期儲存的穩定性試驗（±s）

儲存時間0個月1個月3個月外觀黃色飽滿絮狀黃色飽滿絮狀黃色飽滿絮狀載藥量/%37.07±0.51 36.90±4，21 35.89±2.64包封率/%66.83±2.10 70.31±0.38 68.55±3.20粒徑/nm 205.2±0.7 201.3±1.83 198.3±2.64 PDI 0.135±0.020 0.156±0.011 0.121±0.065電位/mV-30.52±1.9-29.66±2.8-30.71±4.5

4 討 論

冷凍干燥后的膠束有利于儲存，但是在冷凍干燥的過程中，常常會改變納米膠束的狀態，如出現聚集等現象。凍干保護劑又稱為凍干賦形劑，能使冷凍干燥產物色澤一致，質地良好，具有一定的物理強度和良好的復溶性。研究分別以凍干粉末的外觀狀態、復溶性以及載藥量、包封率等作為評價指標，對4種常用成本較低的保護劑及其濃度進行了篩選。

在凍干保護劑篩選結果中，不加凍干保護劑的PTX/CRmP膠束凍干制劑呈黃色棉絮狀，表面完整，無塌陷皺縮，加入水探頭超聲后溶解，形成均一的溶液。加入凍干保護劑后的凍干制劑表面均沒有塌陷，色澤均一。以葡萄糖和蔗糖為凍干保護劑的凍干制劑易吸潮、黏稠，容易黏附到瓶壁上，且二者凍干制劑復溶都相對較困難。以甘露醇和乳糖為凍干保護劑的凍干制劑復溶效果好，然而加乳糖的凍干制劑輕微吸潮，且隨著存儲時間的延長黏稠度不斷增加，不利于儲存。綜合復溶后的粒徑、載藥量、包封率等指標，最終確定0.2%甘露醇作為PTX/CRmP膠束的最佳凍干保護劑。

PTX/CRmP膠束凍干制劑與常用輸液的配伍穩定性可影響膠束凍干制劑的狀態、藥效的發揮以及用藥安全性。本研究結果顯示：PTX/CRmP膠束凍干制劑更適合與0.9%氯化鈉注射液配伍使用，在24 h內具有良好的穩定性；且PTX/CRmP膠束凍干制劑儲存穩定性良好，在高溫、高濕、長期儲存條件下，其理化性質穩定，有利于該制劑的運輸、儲存及臨床應用。

（致謝：本項目由閩臺中藥分子生物技術國家地方聯合工程研究中心、福建省中藥學重點實驗室、福建省中藥資源研究與開發利用重點實驗室完成并提供幫助。）