基于lncRNA NEAT1與Nrf2/ARE通路研究榮筋拈痛方延緩膝骨關節炎軟骨退變作用機制

付長龍，謝新宇，邱志偉，黃艷峰，金靈璐，李西海

1 福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州 350122；2 福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州 350122；3 福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建福州 350122

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種因生物因素及力學異常等引起關節結構與組織形態紊亂，致使膝關節功能退變乃至喪失的關節疾病［1］。其顯著的病理表現為關節軟骨變性、退化，滑膜炎性浸潤以及繼發性骨贅形成，臨床常表現為患膝關節的慢性疼痛、屈伸活動不利等癥狀，病程后期還可出現關節活動受限甚至致殘，嚴重危害中老年人的健康［2-3］。KOA 歸屬于中醫“膝痹”范疇，其病位在骨，歷代醫家認為其病機主要與肝、腎虧虛，筋骨失養等密切相關，病機屬性為本虛標實，本痿標痹，故對其治則宜行補腎柔肝、除痹消痛之法［4-7］。

課題組前期從《清宮配方集成》中篩選治療KOA 的高頻、核心用藥組方，以中醫“肝主筋、腎主骨”理論為核心，重新組方成榮筋拈痛方。該方經國醫大師陳可冀院士審定，由牛膝、當歸、獨活、羌活、防風、甘草組成，用于臨床治療KOA 具有良好療效［8］。通過計算機分子模擬技術分析發現，榮筋拈痛方治療KOA 的作用機制可能與核因子NF-E2 相關因子/抗氧化元件（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）信號通路相關［9］。KOA軟骨受炎性因子影響導致軟骨中誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達升高從而激活Nrf2/ARE 通路。其中，Kelch 樣ECH 相關蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）是Nrf2/ARE 通路中的關鍵調控因子，激活通路后引起下游血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶-1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1，NQO-1］表達變化。研究證實，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在KOA 病理進程中發揮了重要調控作用［10-11］，其中，lncRNA NEAT1 在骨關節炎軟骨中表達上調，并促進軟骨細胞凋亡，加劇軟骨變性［12-13］。研 究 表 明，lncRNA NEAT1 可 以 調 節Nrf2/ARE 通路［14］。因此，本研究基于前期臨床及網絡藥理學研究基礎，觀察榮筋拈痛方對KOA 模型大鼠lncRNA NEAT1 及Nrf2/ARE 通路的影響，探討該方延緩膝骨關節炎軟骨退變的機制，為其臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF 級2 月齡雄性SD 大鼠45 只，體質量（300±10）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供［實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005］；飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心［使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007］，實行分籠飼養，自由飲水，標準飼料喂養。

1.2 實驗藥物

榮筋拈痛方顆粒（江陰天江藥業有限公司，規格：9.5 g/袋，生產批號：2006001），將其溶于100 mL生理鹽水中，配制成濃度為0.095 g/mL 的榮筋拈痛方溶液。

1.3 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅（北京索萊寶科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、RIPA 裂解液（radio immuno precipitation assay）、蛋白上樣緩沖液、10×電泳液（上海碧云天生物技術有限公司）；10×Tris-HCl 緩沖鹽溶液-吐溫（10×Tris buffered saline-tween，10×TBST，北京索萊寶科技有限公司）；Nrf2抗體、HO-1抗體、Keap1抗體、iNOS抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）、NQO-1 抗體（博士德生物工程有限公司），GAPDH（美國Signalway Antibody有限公司）；HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；LncRNA NEAT1（Forward：TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG，Reverse：TCTCCTTGCCAAGCTTCCTTC）、GAPDH（Forward：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，Reverse：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC）引物（福州尚亞生物技術有限公司）；微量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司，NanoDrope 2000）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，CFX96）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及動物造模 45 只大鼠適應性喂養1 周后，采用隨機數字表法分為空白組和碘乙酸鈉組，每組分別15 只、30 只。采用2 %戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，右側膝關節腔注射20 mg/mL 碘乙酸鈉0.05 mL，空白組注射等量生理鹽水。術后1 周可見大鼠活動頻率下降，驅趕運動時出現跛行，大鼠膝關節腫脹，表明成功復制KOA 模型［15］。造模后的碘乙酸鈉組采用隨機數字表法分為模型組和榮筋拈痛方組，每組15 只。按臨床等效劑量換算［16］，榮筋拈痛方組的灌胃劑量為1.9 g/（kg·d），即0.095 g/mL 的榮筋拈痛方溶液10 mL/d，分早晚2 次灌胃，連續灌胃8周，灌胃劑量依據大鼠體質量每周計算調整；空白組和模型組給予等量生理鹽水灌服。

1.4.2 組織取材與處理 末次灌胃結束后，采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪開表皮直至暴露出以右膝關節為中心約3 cm×3 cm 的區域。去除骨組織表面附著的肌肉及各種結締組織，切開韌帶小心打開關節腔，注意刀口避免劃傷軟骨組織表面。每組隨機選擇3只切取右側股骨置于多聚甲醛中固定以備后續HE 染色。收集其余大鼠右膝關節表面的軟骨組織，置于液氮中轉移至-80 ℃冰箱，以備后續進行基因及蛋白檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 軟骨組織病理改變 采用HE 染色法觀察各組大鼠右膝軟骨組織病理改變情況。常規制備大鼠股骨內側髁組織石蠟標本，組織切片后進行常規脫蠟復水，蘇木精浸染10 min，流水輕柔漂洗1 min，快速返藍（1%鹽酸乙醇溶液）2 s，再經0.5%伊紅染液浸染5 s，封固（中性樹脂）后進行鏡下觀察并拍照。

1.5.2 軟骨組織Nrf2/ARE 通路蛋白表達情況 采用Western blot 法檢測各組大鼠軟骨組織中Nrf2、HO-1、NQO-1、Keap1、iNOS 蛋白含量。提取各組軟骨組織總蛋白，BCA 蛋白定量，配制12%分離膠和5%濃縮膠，上樣后進行電泳，采用半干式進行轉膜，脫脂牛奶封閉2 h 后洗膜，再將各條膜放入預先配置好的Nrf2、HO-1、NQO-1、Keap1、iNOS 的一抗中置于4°C 冰箱搖床過夜進行充分震蕩反應，次日取出一抗，洗膜后加入二抗，待二抗反應處理后，使用ECL 發光液進行顯影，于凝膠成像儀下進行曝光成像，最后分析儲存。

1.5.3 軟骨組織lncRNA NEAT1 表達情況 采用實時PCR 法檢測各組大鼠軟骨組織中lncRNA NEAT1表達水平。將軟骨組織研磨后，采用Trizol 法提取總RNA，微量紫外分光光度計檢測各樣本RNA濃度（g/L）和A260/A280 值。根據反轉錄試劑盒說明書，取1 μg 總RNA 反轉錄成cDNA，反轉錄條件：55 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃。以1 μL cDNA 為模板擴增lncRNA NEAT1。擴增反應條件：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個循環。以GAPDH為內參照基因，計算目的基因2-ΔΔCt，比較分析各組lncRNA NEAT1水平變化。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布，數據采用（±s）表示，組間比較采用方差分析，若方差齊，兩兩比較采用LSD-t法；若方差不齊，兩兩比較則采用Games-Howell 法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠軟骨組織病理改變情況

HE 染色結果顯示，空白組大鼠軟骨組織切線層連續且完整，細胞質及其基質成分分布均勻且著色淺紅，移行層中軟骨細胞縱向條索狀分布且排列規律，輻射層、鈣化層結構完整且清晰；模型組軟骨組織切線層發生破壞，纖維方向出現偏移、變薄，軟骨細胞外露且抱團簇集生長，移行層與輻射層的軟骨細胞呈無序分布排列狀態，部分軟骨細胞出現鈣化，鈣化層軟骨細胞鈣化現象明顯，鈣化層與軟骨下骨間的黏合線起伏較大，且連續性部分中斷；榮筋拈痛方組的切線層與關節面基本平行且完整，移行層、輻射層、鈣化層及其他層次相對清晰可辨。見圖1。

圖1 軟骨組織HE染色圖（×200）Figure 1 HE staining results of cartilage tissue(×200)

2.2 3 組大鼠關節軟骨組織中Nrf2/ARE 通路相關蛋白表達比較

Western blot 結果顯示，與空白組比較，模型組Keap1、iNOS 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，榮筋拈痛方組Keap1、iNOS蛋白表達明顯更低（P＜0.05），Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表達明顯更高（P＜0.05）。這提示榮筋拈痛方可上調Nrf2 信號及抗氧化信號分子表達，下調促氧化信號分子表達。見表1、圖2。

表1 3組大鼠關節軟骨中Nrf2/ARE通路相關蛋白表達比較（±s）Table 1 Comparison of Nrf2/ARE pathway related protein expression in articular cartilage in three groups（±s）

表1 3組大鼠關節軟骨中Nrf2/ARE通路相關蛋白表達比較（±s）Table 1 Comparison of Nrf2/ARE pathway related protein expression in articular cartilage in three groups（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

組別空白組模型組榮筋拈痛方組n333 Keap1/GAPDH 0.560 5±0.059 5 0.932 6±0.063 91）0.659 5±0.089 12）Nrf2/GAPDH 0.292 3±0.043 9 0.103 6±0.021 11）0.198 8±0.036 52）HO-1/GAPDH 0.559 2±0.042 1 0.313 0±0.025 11）0.627 1±0.040 82）NQO-1/GAPDH 0.880 3±0.170 3 0.404 7±0.067 11）0.692 9±0.063 62）iNOS/GAPDH 0.386 1±0.016 1 0.853 5±0.015 81）0.553 4±0.042 72）

圖2 3組大鼠關節軟骨中Nrf2/ARE通路相關蛋白條帶圖Figure 2 Protein strip diagram of Nrf2/ARE pathway indicator in articular cartilage in three groups

2.3 3 組大鼠關節軟骨組織中lncRNA NEAT1 水平比較

Real-time PCR 結果顯示，與空白組比較，模型組lncRNA NEAT1 水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，榮筋拈痛方組lncRNA NEAT1 水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠關節軟骨組織中lncRNA NEAT1水平比較（±s）Table 2 Expression of lncRNA NEAT1 in articular cartilage in three groups（±s）

表2 3組大鼠關節軟骨組織中lncRNA NEAT1水平比較（±s）Table 2 Expression of lncRNA NEAT1 in articular cartilage in three groups（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group, 1) P＜0.05; compared with the model group,2)P＜0.05.

組別空白組模型組榮筋拈痛方組n333 NEAT1/GAPDH 1 1.799 8±0.085 11）1.451 6±0.109 52）

3 討 論

3.1 KOA 大鼠關節軟骨退變可能與氧化應激反應有關

本研究結果顯示，HE 染色可觀察到模型組大鼠軟骨變薄、細胞無序分布，這提示模型組關節軟骨發生明顯退行性改變，與GUZMAN 等［17-18］研究一致。此外，本研究結果顯示，模型組軟骨組織中lncRNA NEAT1 水平升高，Keap1、iNOS 蛋白含量顯著升高，Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白含量顯著降低，提示氧化應激反應參與KOA 大鼠關節軟骨退變。這可能與以下因素有關：①生理條件下軟骨中低水平ROS 有助于維持軟骨細胞穩態及功能，而KOA 軟骨受到炎性因子誘導后iNOS 表達高度上調并產生大量的ROS。過量ROS 會激活核因子κB 途徑增加炎癥，同時抑制細胞外基質合成并誘導基質降解蛋白酶表達，誘導軟骨細胞凋亡最終導致軟骨降解［19-21］。②過度產生ROS會導致軟骨細胞氧化應激，激活以Nrf2/ARE通路為代表的抗氧化應激防御系統。Keap1具有氧化還原感受器功能，非氧化應激時與Nrf2 結合，氧化應激時則與Nrf2 解離引起下游HO-1、NQO-1 表達升高以及時清除過量的ROS，產生抗氧化效果［22-23］。而KOA 軟骨中Nrf2 表達失調，同時HO-1、NQO-1 表達受炎癥因子抑制，不能有效清除細胞中的過量ROS，最終導致關節軟骨降解［24］。③Nrf2/ARE 通路的表達也同時受非編碼RNA 的調控［25］。其中lncRNA NEAT1 在OA 軟骨中高表達，且與調節Nrf2/ARE通路相關［26-27］。lncRNA NEAT1 調節的Nrf2/ARE 信號通路是延緩KOA 軟骨退變的潛在途徑。

3.2 榮筋拈痛方延緩KOA 大鼠軟骨退變可能與Nrf2/ARE通路抗ROS作用有關

本研究結果表明，與模型組比較，榮筋拈痛方組大鼠關節軟骨退變程度明顯減輕，lncRNA NEAT1表達水平下調，Keap1、iNOS 蛋白含量明顯降低，Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白含量明顯升高，這提示榮筋拈痛方延緩KOA 大鼠軟骨退變可能與Nrf2/ARE 通路抗ROS作用有關。這可能與以下因素有關：①榮筋拈痛方干預后，軟骨組織中iNOS 表達顯著降低，細胞中ROS 的產生減少，從而緩解氧化應激反應，延緩OA 軟骨退變。②HO-1、NQO-1 是Nrf2 的下游靶蛋白，其表達上調有助于抵抗細胞氧化應激帶來的損傷［28-31］，榮筋拈痛方作用于Nrf2/ARE 通路，下調Keap1表達，上調Nrf2蛋白表達，調節下游HO-1及NQO-1，通過清除過量ROS、緩解軟骨組織氧化應激達到延緩OA軟骨退變的療效。③榮筋拈痛方干預下調軟骨組織lncRNA NEAT1 表達，進而調節Nrf2/ARE 通路，促使Keap1 蛋白表達降低，Nrf2、HO-1及NQO-1蛋白表達升高，增強Nrf2/ARE 通路抗ROS 作用以緩解軟骨氧化應激，延緩OA 軟骨退變。

4 小 結

榮筋拈痛方在延緩KOA 大鼠軟骨退變方面具有一定療效，其機制可能與其下調lncRNA NEAT1水平，上調Nrf2 信號及抗氧化信號分子表達，下調促氧化信號分子表達，抑制氧化應激水平有關。本研究仍存在一些不足，如lncRNA NEAT1 調節Nrf2/ARE 通路的作用機制尚不明確，還需在后續研究中進一步驗證明確。