跑步對香煙提取物所致小鼠肺氣腫模型的影響及機制研究

李永榮，謝海彬，李 紅，孫 杰

1 甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅蘭州 730020；2 深圳市羅湖區中醫院，廣東深圳 518001；3 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是臨床常見的呼吸系統疾病，以持續性呼吸系統癥狀為主要臨床表現，肺氣腫是其最主要的影像學表現［1］。吸煙是COPD 發生的主要危險因素，長期吸煙會導致肺部炎癥，引發肺結構改變［2］。研究表明，COPD發展不僅與肺部炎癥有很大關系，還與全身炎癥反應有關［3-4］。研究發現，在COPD 患者肺組織活檢中，氣道上皮細胞中信號傳導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表達明顯增加［5-6］。STAT3是細胞內介導凋亡及炎癥信號轉導重要通路蛋白，STAT3活化后能夠調節下游多種基因表達并參與細胞凋亡和炎癥的調控［7］。

臨床研究表明，有氧運動可改善COPD 患者癥狀，提高其生活質量［8］。實驗研究表明，有氧運動可降低肺氧化應激和肺部炎癥［9］，但有氧運動對COPD動物全身炎癥和炎癥轉錄因子的影響尚未見報道。本研究通過觀察跑步對香煙提取物致肺氣腫小鼠肺部炎癥、全身炎癥及STAT3 表達的影響，探討跑步運動改善COPD的相關機制。

1 材料和方法

1.1 主要實驗儀器和試劑

電動跑步機（安徽正華生物儀器設備有限公司）；芙蓉牌香煙（湖南中煙工業有限責任公司）；Rabbit Anti-STAT3、p-STAT3 Polyclonal Antibody（美 國Sigma公司）；白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10、IL-17和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）ELISA試劑盒（天根生物科技有限公司）。

1.2 實驗動物

選擇6～8周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠40只，體質量20～25 g，購買并飼養于甘肅中醫藥大學動物中心［實驗動物生產許可證號：SYXK（甘）2015-0005］。甘肅中醫藥大學動物中心飼養條件：自由飲食，環境溫度在23～25 ℃，12 h/12 h明暗交替。

1.3 動物分組與模型制備

實驗動物采用隨機數字表法分為對照組、運動組、肺氣腫組和肺氣腫＋運動組，每組10 只。小鼠適應性飼養3 d 后，參照ZHANG 等［10］文獻進行香煙提取物提取及模型制備。對照組和運動組小鼠在實驗第0、11、22天分別通過腹腔注射0.3 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）；肺氣腫組和肺氣腫＋運動組小鼠在實驗第0、11、22天分別通過腹腔注射0.3 mL 香煙提取物（相當于香煙7 支/d）。本研究方案中對動物處理均按照《關于善待實驗動物的指導性意見》執行，本實驗方案經甘肅中醫藥大學醫學研究倫理委員會審批通過（倫理審批號：IACUC 2016-039）。

1.4 干預方法

在實驗開始前，運動組和肺氣腫＋運動組小鼠在跑步機上進行3 d 適應，10 min/d。實驗開始后第23～29 天，運動組和肺氣腫＋運動組小鼠進行跑步機有氧訓練，15 m/min，30 min/d 持續運動7 d；對照組和肺氣腫組小鼠第23～29天在籠內自由活動。

1.5 觀察指標

1.5.1 小鼠肺氣腫程度評價 采集血液和支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）后，每組隨機選5只小鼠取出左側肺組織，用4%福爾馬林灌注并固定24 h。進行組織包埋、切片后，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察小鼠肺組織病理改變情況，光學顯微鏡下觀察拍照，計算肺泡弦長［11］。

1.5.2 小鼠肺部炎癥評估 通過分析BAL 中炎癥細胞以及炎癥因子水平來評估肺部炎癥。采血后，對小鼠進行氣管切開和插管，并用1 mL PBS 溶液沖洗肺部，收集沖洗液即BAL。采用血細胞計算器對BAL 中白細胞、中性粒細胞和淋巴細胞進行計數。采用ELISA 法檢測BAL 中IL-1β、IL-6、IL-10 和IL-17表達水平。

1.5.3 小鼠全身炎癥評估 采用腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉小鼠后，進行剖腹手術，在腔靜脈中采集1 mL血液，采用血液分析儀進行全血細胞（白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞）含量分析；采用ELISA 法檢測血液中IL-1β、IL-10、IL-17 和TNF-α水平。

1.5.4 免疫印跡分析 收集各組另外5只小鼠左肺組織，加入全細胞裂解液，BCA 法進行蛋白定量，加入Loading Buffer 制備成電泳樣品，取30 μg 進行SDS-PAGE 電泳，然后轉至PVDF 膜上。經5%牛奶封閉1 h 后用PBS 溶液洗膜。分別加入兔源STAT3一抗（1∶1 000）和p-STAT3 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育3 h。回收一抗、洗膜后加入山羊抗鼠二抗（1∶25 000），室溫孵育1 h。洗膜后加入顯影劑，利用化學發光掃描系統顯影并攝片，采用Quantity One 圖像分析軟件對吸光度值進行分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件進行分析。計量資料符合正態分布，數據以（±s）表示，方差齊時，組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組小鼠肺氣腫程度比較

小鼠肺組織病理染色結果顯示，對照組和運動組小鼠肺泡形態結構完整，氣管及血管周圍未見炎細胞浸潤；肺氣腫組小鼠氣管及血管周圍可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁破碎，形成肺大皰；肺氣腫＋運動組小鼠氣管周圍可見少量炎性細胞浸潤，肺泡變小。見圖1。肺泡弦長計算結果顯示：與對照組比較，運動組小鼠肺泡弦長無明顯改變（P＞0.05），肺氣腫組及肺氣腫＋運動組小鼠肺泡弦長均明顯增大（P＜0.05）。與肺氣腫組比較，肺氣腫＋運動組小鼠肺泡弦長明顯減小（P＜0.05）。見表1。

表1 4組小鼠肺泡弦長比較（±s） μmTable 1 Comparison of chord length of alveolus pulmonis in four groups（±s） μm

表1 4組小鼠肺泡弦長比較（±s） μmTable 1 Comparison of chord length of alveolus pulmonis in four groups（±s） μm

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與肺氣腫組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group, 1) P＜0.05; compared with the emphysema group,2)P＜0.05.

組別對照組運動組肺氣腫組肺氣腫+運動組n 10 10 10 10肺泡弦長38.24±4.10 39.33±4.32 57.84±6.011）45.90±4.231）2）

圖1 4組肺組織HE染色圖（×100）Figure 1 HE staining of lung tissue in four groups(×100)

2.2 4組小鼠肺部炎癥情況比較

與對照組比較，肺氣腫組小鼠BAL 中白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞含量及IL-1β、IL-6、IL-17 表達水平均升高，而IL-10 水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；肺氣腫＋運動組小鼠BAL 中白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞含量及IL-1β、IL-6、IL-17 表達水平升高，IL-10 水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與肺氣腫組比較，肺氣腫＋運動組BAL 中白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞含量及IL-1β、IL-6、IL-17 表達水平更低，IL-10 水平更高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 4組BAL中炎性細胞含量及細胞因子表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of inflammatory cells and cytokines of BAL in four groups（±s）

表2 4組BAL中炎性細胞含量及細胞因子表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of inflammatory cells and cytokines of BAL in four groups（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與肺氣腫組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the emphysema group,2)P＜0.05.

組別對照組運動組肺氣腫組肺氣腫+運動組n 10 10 10 10白細胞/（×104/mL）12.16±1.42 12.64±1.51 25.05±2.341）19.83±2.011）2）中性粒細胞/（×104/mL）2.01±0.23 1.84±0.19 16.28±2.141）5.09±0.631）2）淋巴細胞/（×104/mL）1.04±0.12 0.87±0.14 7.13±0.761）3.93±0.451）2）IL-1β/（pg/mL）250.07±30.53 260.04±32.82 1490.03±156.741）298.28±31.341）2）IL-6/（pg/mL）7.53±0.84 12.04±1.30 74.64±8.121）25.81±2.931）2）IL-17/（pg/mL）20.02±2.34 24.25±2.53 69.39±7.141）28.19±2.031）2）IL-10/（pg/mL）279.23±28.54 300.71±32.36 196.54±20.711）248.07±34.231）2）

2.3 4組小鼠血液炎癥情況比較

與對照組比較，肺氣腫組小鼠血液中白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞含量及IL-1β、IL-17、TNF-α表達水平升高，IL-10 水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；肺氣腫＋運動組小鼠血液中IL-1β、IL-17和TNF-α表達水平均升高，IL-10表達水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與肺氣腫組比較，肺氣腫＋運動組小鼠血液中白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞含量及IL-1β、IL-17 和TNF-α 表達水平較低，IL-10 水平較高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4組小鼠血液中炎性細胞及細胞因子比較（±s）Table 3 Comparison of inflammatory cells and cytokines of blood in four groups（±s）

表3 4組小鼠血液中炎性細胞及細胞因子比較（±s）Table 3 Comparison of inflammatory cells and cytokines of blood in four groups（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與肺氣腫組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the emphysema group,2)P＜0.05.

組別對照組運動組肺氣腫組肺氣腫+運動組n 10 10 10 10白細胞/（×104/mL）1.84±0.31 1.93±0.30 4.36±0.621）1.64±0.212）中性粒細胞/（×104/mL）0.03±0.00 0.02±0.00 0.08±0.011）0.04±0.002）淋巴細胞/（×104/mL）1.20±0.23 1.21±0.19 3.14±0.381）1.53±0.322）IL-1β/（pg/mL）230.04±24.03 220.17±23.32 1380.42±150.141）600.74±65.231）2）IL-17/（pg/mL）13.18±2.03 18.80±2.34 26.36±2.831）20.05±2.471）2）TNF-α/（pg/mL）95.13±10.42 90.26±9.70 506.41±52.631）240.26±29.311）2）IL-10/（pg/mL）210.24±23.91 232.53±25.06 156.64±19.231）310.05±32.511）2）

2.4 4組小鼠肺組織STAT3表達比較

與對照組比較，肺氣腫組小鼠肺組織中p-STAT3表達水平升高（P＜0.05）；肺氣腫＋運動組小鼠肺組織中p-STAT3 表達水平升高（P＜0.05）。與肺氣腫組比較，肺氣腫＋運動組小鼠肺組織中p-STAT3表達水平降低（P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 4組肺組織STAT3和p-STAT3蛋白典型免疫印跡圖Figure 2 Typical immunoblot images of STAT3 and p-STAT3 proteins of lung tissues in four groups

表4 4組小鼠肺組織STAT3和p-STAT3蛋白表達比較（±s）Table 4 Comparison of STAT3 and p-STAT3 protein expression of lung tissue in four groups（±s）

表4 4組小鼠肺組織STAT3和p-STAT3蛋白表達比較（±s）Table 4 Comparison of STAT3 and p-STAT3 protein expression of lung tissue in four groups（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與肺氣腫組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group, 1) P＜0.05; compared with the emphysema group,2)P＜0.05.

組別對照組運動組肺氣腫組肺氣腫+運動組n 10 10 10 10 STAT3 1.00±0.10 0.94±0.21 1.07±0.11 1.14±0.23 p-STAT3 1.00±0.10 1.13±0.24 8.92±0.941）1.59±0.301）2）

3 討 論

研究表明，香煙可引起慢性肺部炎癥，這種炎癥不僅會影響氣道，而且會影響肺遠端，促進肺實質發展［12］。作為一種有效的促炎劑，香煙可激活多種促炎細胞因子（如IL-1β、IL-6、IL-17 和TNF-α），這些細胞因子在肺部炎癥和結構改變中起著關鍵的作用［13-15］。在COPD 和哮喘等慢性呼吸道疾病中，促炎細胞因子會吸引和激活白細胞進入炎癥部位，導致非溶解性炎癥反應，使炎癥過程永久化［16］。有研究表明，在COPD 患者的肺組織中，中性粒細胞作為主要炎性細胞，參與了氣道重塑和氣道阻塞進展［17］。雖有研究表明，有氧運動能有效改善COPD預后，但其具體作用機制仍不明確［18］。為此，本研究旨在觀察跑步對肺氣腫小鼠肺部及全身炎癥細胞和細胞因子影響，并對其機制進行初步探討。

3.1 跑步可有效減輕肺氣腫小鼠肺部及全身炎癥

本研究采用香煙提取物制備小鼠肺氣腫模型，與對照組比較，模型組小鼠肺組織出現明顯肺氣腫表現，BAL 和血液中炎性細胞含量及促炎因子水平升高，抗炎因子水平升高。與模型組比較，肺氣腫＋運動組小鼠肺氣腫程度較輕，BAL 和血液中炎性細胞含量及促炎因子水平較低，抗炎因子水平降低升高，這提示跑步可以有效減輕肺部及全身炎癥反應，延緩模型小鼠肺氣腫進程。這可能與以下因素有關：①炎性細胞（如中性粒細胞等）可以釋放出多種介質，這些介質不僅與炎癥過程有關，還與氣道重塑有關［19］。跑步運動通過抑制肺部及全身炎性細胞及炎性因子表達，使炎性細胞在肺中遷移減少，抑制氣道重塑，從而有利于維持肺的完整性和功能性［20-21］。②IL-10 作為一種抗炎細胞因子，可拮抗其他細胞因子促炎作用，從而控制炎癥。研究報道，IL-10 主要是通過抑制κB 抑制因子激酶激活或NF-κB 的DNA 結合能力，從而抑制NF-κB 啟動相關前炎癥因子基因的轉錄［22］。這與研究顯示，有氧運動可改善COPD 大鼠肺功能表現，減輕COPD大鼠肺組織病理損害，還可促使COPD 大鼠肺組織中炎癥因子表達下降的結果相似［23］。

3.2 跑步減輕肺氣腫小鼠肺部及全身炎癥機制與調控STAT3表達有關

研究表明，長期暴露于香煙煙霧可激活氣道上皮細胞，觸發與COPD 相關炎癥和纖維化反應信號通路（如STAT）［24］。STAT3 是STAT 家族的主要成員，在不同細胞及組織廣泛表達，是IL-6 信號傳遞中的急性反應因子［25］。IL-6 通過STAT3 與IL-21、IL-23 一起調節Th17 細胞分化，從而增加IL-17 分泌［26］。而IL-17 通過調控氣道中炎癥細胞，促進中性粒細胞趨化及調控因子表達，從而促進中性粒細胞黏附和浸潤［27-28］。本研究結果顯示，與對照組比較，肺氣腫組小鼠BAL 和血液中IL-17水平升高，肺組織中p-STAT3 表達水平也升高；與肺氣腫組比較，肺氣腫＋運動組小鼠BAL 和血液中IL-17 水平降低，肺組織中p-STAT3 表達水平也降低，表明跑步可能通過抑制小鼠肺組織STAT3 激活，減少IL-17 分泌，發揮對肺氣腫小鼠肺部和全身炎癥的抑制作用。

4 小 結

跑步可以減輕肺氣腫模型小鼠肺部氣道炎癥，還能抑制肺氣腫小鼠全身炎癥，減輕肺氣腫病理表現，其機制可能與抑制STAT3 的激活有關。下一步可以利用基因敲除小鼠或STAT3 小分子抑制劑FLLL31進行研究，以進一步檢驗STAT3與小鼠肺氣腫炎癥反應之間的關系。