基于DigiGait成像系統的帕金森病模型大鼠行為學分析

劉欣昊，馬書杰，丁道芳，羅開亮，馬欣然，姜汶伶，胡 軍，*

1 上海中醫藥大學康復醫學院，上海 201203；2 上海市第二康復醫院，上海 200441

帕金森病（Parkinson's disease，PD）作為全球第二大慢性退行性神經系統疾病［1］，造成的社會負擔在不斷增加。流行病學調查顯示，PD全人群患病率約0.3%［2］。PD 的臨床表現主要包括運動癥狀與非運動癥狀兩大類［3］，其中由于患者步幅長度縮短、步行速度減緩、邁步頻率減小等引起的步行功能障礙是PD 運動癥狀的典型表現之一［4-6］。PD 運動癥狀的發病機制仍不清楚，目前的康復治療手段只能延緩癥狀的發生，但無法根治。PD動物模型的建立對探究PD 運動癥狀的發病機制及康復治療的作用機制至關重要，相關研究也得到了廣泛關注［7-8］。其中，PD 動物模型的行為學研究能更直觀地表現PD的運動癥狀，為篩選更有效的康復治療手段提供理論依據，因此行為學的檢測方式和指標選擇成為了研究的熱點。PD 動物模型行為學檢測的主要內容包括肌力、協調功能、運動功能等，如懸掛實驗可評價動物的協調功能；曠場實驗可測試動物的運動距離及平均速度；步距實驗可檢測動物的平均步長等［9-11］。但現有的檢測方法可能存在結果單一、耗時長、出現運動習慣等問題，這對分析結果可能產生較大影響。

DigiGait 成像系統作為一種新型動物行為學檢測手段，能從空間子成分、時間子成分、姿勢子成分3 個維度進行分析［12］，具有多重結果、單次測量、無損害等優點，并根據其系統的獨特性直接針對模型的平衡及協調功能進行量化分析。因此，本研究將運用DigiGait 成像系統對6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）誘導的PD 模型大鼠進行行為學分析，探討該方法應用于PD 相關基礎研究中的潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇清潔級雄性SD 大鼠24只，6～8周齡，體質量（160～200）g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006。飼養環境：動物房溫度（23±2）℃，相對濕度60%～65%。本實驗方案經上海中醫藥大學動物實驗中心倫理委員會批準（審批號：PZSHUTCM201204004）。

1.2 主要實驗試劑及儀器

DigiGait 成像系統（美國Mouse Specifics 公司，型號：MSI-SOF-DIG）；增強型小動物麻醉機（型號：R540）、異氟烷（批號：R510-22）、大鼠腦立體定位儀（型號：68018）均購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；微量進樣器（上海高鴿工貿有限公司，規格：5 μL）；小動物顱骨鉆（深圳賽德克斯醫療科技有限公司，型號：78001）；6-羥基多巴胺（批號：MKCJ2199）、抗壞血酸（批號：WXBD2611V）、阿撲嗎啡（批號：LRAC 4767）均購自美國Sigma公司。

1.3 模型制備和分組

1.3.1 實驗分組 大鼠適應性飼養7 d后，按隨機數字表法分為正常組、模型組及假手術組，每組8只。

1.3.2 模型制備 模型組采用單側2點法腦注射6-OHDA 誘導建立PD 大鼠模型［13-14］。異氟烷氣體麻醉大鼠并固定于腦立體定位儀上，暴露顱骨，確定2 個定位點（第1 定位點：前囟后5.2 mm，中線右側1.0 mm，硬膜下9 mm；第2 定位點：前囟后5.2 mm，中線右側1.5 mm，硬膜下8.5 mm）并標記。輕緩鉆透顱骨，用微量注射器抽取濃度為2 μg/μL 的6-OHDA 溶液（使用含0.2%抗壞血酸溶液配制），每定位點注射3 μL。其中進針速度1 mm/min，注射速度1 μL/min，留針時間5 min，退針速度1 mm/min，所有操作完成后縫合皮膚。假手術組采用相同定位及注射方式注射同等劑量的0.2%抗壞血酸溶液建立假手術模型。模型制備手術后第7 天，通過腹腔注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡，誘導其進行旋轉測試判定PD 模型大鼠的制備情況（旋轉圈數＞7 次/min 表明模型合格）［15］。正常組不進行任何手術處理。

1.4 觀察指標

運用DigiGait成像系統檢測各組大鼠行為，評估前跑臺適應性訓練3 d。檢測時大鼠可自由穿行在預設長度的透明跑帶上，跑帶速度為10 m/min［16］，通過跑帶下方的攝像機連接成像系統自動識別大鼠4只腳底部的顏色，同步進行描繪處理，提供包含時間子成分（擺動時長、制動時長、觸地時長、站立系數）、空間子成分（步幅頻率、步幅長度、觸地寬度、步態對稱性、腳爪重疊距離、腳爪放置定位）及姿勢子成分（腳爪角度、步偏角、腳爪面積）等3個維度的生理學步態信號參數［17］，其中步態對稱性作為協調功能特定指標，腳爪放置定位作為平衡功能特定指標。

1.5 統計學方法

采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析，計量資料服從正態分布，數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組跑帶運動步態時間子成分變化比較

與正常組比較，假手術組跑帶運動步態時間子成分無明顯變化（P＞0.05）；模型組左前肢、左后肢及右前肢在運動過程中的擺動時長、制動時長及觸地時長明顯延長（P＜0.05），右后肢制動時長及擺動時長明顯延長（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組左前肢、左后肢及右前肢在運動過程中的擺動時長、制動時長及觸地時長明顯更長（P＜0.05），右后肢制動時長明顯更長（P＜0.05）。見表1。

表1 3組跑帶運動步態時間子成分比較（±s）Table 1 Comparison of time subcomponents in three groups（±s）

表1 3組跑帶運動步態時間子成分比較（±s）Table 1 Comparison of time subcomponents in three groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與假手術組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the sham operation group,2)P＜0.05.

組別正常組假手術組模型組n 8 8 8肢體部位左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢擺動時長/s 0.0 9 0±0.0 2 6 0.0 9 4±0.0 5 2 0.0 8 9±0.0 1 7 0.0 8 1±0.0 1 4 0.1 3 0±0.0 2 6 0.0 9 9±0.0 4 5 0.1 2 0±0.0 2 6 0.1 2 4±0.0 3 9 0.1 6 5±0.0 3 4 1）2）0.1 2 6±0.0 7 1 1）2）0.1 8 5±0.0 2 0 1）2）0.1 4 1±0.0 1 9 1）制動時長/s 0.1 2 3±0.0 1 4 0.1 2 1±0.1 0 3 0.1 1 6±0.0 6 6 0.0 8 8±0.0 5 0 0.0 8 4±0.0 1 2 0.1 8 7±0.0 9 1 0.0 8 2±0.0 4 0 0.0 7 9±0.0 4 7 0.1 8 2±0.0 7 3 1）2）0.2 2 9±0.1 2 3 1）2）0.1 5 1±0.0 2 0 1）2）0.1 5 8±0.0 5 2 1）2）觸地時長/s 0.3 9 2±0.1 1 9 0.4 1 0±0.1 2 3 0.3 0 8±0.0 4 2 0.3 3 2±0.0 3 9 0.4 2 8±0.1 3 7 0.4 6 0±0.0 9 5 0.4 5 9±0.0 5 2 0.4 3 2±0.1 1 2 0.7 8 1±0.1 1 3 1）2）0.5 9 8±0.1 1 7 1）2）0.6 6 8±0.1 1 9 1）2）0.4 1 0±0.0 8 8站立系數1.1 6 3±0.4 4 3 0.9 4 8±0.2 2 7 0.9 3 4±0.2 1 6 0.9 4 4±0.1 3 8 0.8 8 1±0.2 6 7 0.8 9 3±0.2 2 2

2.2 3組跑帶運動步態空間子成分變化比較

與正常組比較，假手術組跑帶運動步態空間子成分無明顯變化（P＞0.05）；模型組前后肢觸地寬度明顯增加（P＜0.05），四肢的步幅頻率、左側肢步幅長度及大鼠的腳爪放置位置與步態對稱性明顯降低（P＜0.05），但右側肢步長和左右側肢的腳爪重疊距離無明顯變化（P＞0.05）。與假手術組比較，模型組前后肢觸地寬度明顯增加（P＜0.05），四肢的步幅頻率、左側肢步幅長度及大鼠的腳爪放置位置與步態對稱性明顯降低（P＜0.05），但右側肢步幅長度和左右側肢的腳爪重疊距離無明顯變化（P＞0.05）。見表2。

表2 3組跑帶運動步態空間子成分比較（±s）Table 2 Comparison of spatial subcomponents in three groups（±s）

表2 3組跑帶運動步態空間子成分比較（±s）Table 2 Comparison of spatial subcomponents in three groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與假手術組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the sham operation group,2)P＜0.05.

組別正常組假手術組模型組n 8 8 8肢體左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢步幅頻率/（步/s）2.4 5 0±0.9 1 1 2.5 6 2±0.3 6 6 2.5 7 5±0.2 3 7 2.4 5 0±0.2 4 5 2.8 8 7±0.3 9 7 2.5 5 5±0.3 0 0 2.5 2 9±0.2 6 2 2.5 6 1±0.3 3 3 1.7 2 5±0.3 8 5 1）2）2.0 5 6±0.4 2 3 1）2）1.7 6 2±1.0 1 6 1）2）2.0 7 0±0.3 2 6 1）2）步幅長度/c m 1 1.1 6 2±2.8 0 1 1 1.8 5 6±2.3 9 0 1 1.6 0 0±1.4 7 0 1 2.5 0 0±2.6 8 3 9.7 5 0±1.6 8 6 9.6 8 8±1.5 3 6 8.8 6 2±0.8 5 1 9.1 3 8±0.7 1 3 5.2 0 0±1.2 3 4 1）2）8.9 2 8±2.6 6 0 6.7 2 9±2.3 4 3 1）2）8.6 8 6±1.5 2 5觸地寬度/c m 2.3 6±0.3 3 1.8 3±0.8 8 2.0 4±0.3 8 2.6 6±0.4 1 2.8 3±0.4 7 1）2）3.4 3±0.6 2 1）2）組別正常組假手術組模型組n 8 8 8腳爪重疊距離/c m左側-1.3 1±2.2 1-1.4 3±2.8 3-1.4 3±2.8 3右側0.6 5±2.0 5 0.3 2±1.3 0 0.3 2±1.3 0腳爪放置位置/c m左側0.3 1 5±0.3 7 7 0.4 2 5±0.4 8 2-0.3 3 4±0.4 1 3 1）2）右側0.3 9 1±2.1 3 0 0.4 6 9±1.1 7 3-0.2 7 3±1.7 6 4 1）2）步態對稱性0.9 9 4±0.1 0 1 1.0 0 8±0.0 6 5 0.6 4 9±0.1 3 1 1）2）

2.3 3組跑帶運動步態姿勢子成分變化比較

與正常組比較，假手術組跑帶運動步態姿勢子成分無明顯變化（P＞0.05）；模型組在運動過程中左前肢、左后肢及右后肢與跑帶接觸腳爪面積明顯減少（P＜0.05），右前肢與跑帶接觸腳爪面積、腳爪角度及步偏角均無明顯差異（P＞0.05）。與假手術組比較，模型組在運動過程中左前肢、左后肢及右后肢與跑帶接觸的腳爪面積明顯減少（P＜0.05），右前肢與跑帶接觸的腳爪面積、腳爪角度及步偏角均無明顯區別，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 3組跑帶運動步態姿勢子成分比較（±s）Table 3 Comparison of postural subcomponents in three groups（±s）

表3 3組跑帶運動步態姿勢子成分比較（±s）Table 3 Comparison of postural subcomponents in three groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與假手術組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the sham operation group,2)P＜0.05.

組別正常組假手術組模型組n 8 8 8肢體左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢腳爪角度/°6.9 3 8±5.0 2 9 8.6 8 8±3.2 4 4 5.6 0 0±4.4 8 0 7.1 1 3±5.9 4 9 5.3 7 5±2.0 6 3 7.0 2 2±3.7 4 0 5.4 6 2±3.8 6 9 7.3 4 2±5.7 1 2 6.6 1 3±5.5 7 5 7.5 2 9±4.6 1 4 6.9 7 1±5.9 8 2 6.4 1 4±4.7 4 0腳爪面積/c m 2 3.7 6 8±1.7 2 1 3.4 7 6±1.5 4 8 6.0 2 8±1.8 5 2 5.9 4 5±1.8 0 1 4.6 6 6±0.3 8 7 3.3 9 7±0.5 2 9 6.7 7 0±0.5 9 2 6.5 6 6±0.7 2 5 2.2 7 1±0.9 3 9 1）2）2.7 7 7±1.4 0 4 4.5 1 0±2.1 3 5 1）2）5.0 1 9±2.1 7 7 1）2）步偏角/°6 6.1 2±7.3 9 7 2.9 8±9.7 7 7 1.2 2±6.1 1 6 8.9 2±6.9 9 6 5.3 7±7.2 8 5 6.8 7±1 0.2 7

3 討 論

3.1 DigiGait 成像系統可反映PD 模型大鼠的步行功能障礙

步行功能與日常生活活動能力具有密切關系，因此，改善步行功能障礙是PD 患者康復治療過程的重點。本研究觀察到PD 模型大鼠出現腳底拖拽、步長縮短、步速降低等步態，通過DigiGait 成像系統檢測發現PD 模型大鼠的步長、步頻明顯減小，而擺動時間、制動時間及觸地時間卻明顯延長。這與臨床上PD 患者出現的步行功能障礙“凍結步態”相一致，其主要表現為整體速度降低，手臂擺動減少，步幅縮短，站立階段持續時間增加，雙下肢與地面呈粘連狀態、無法起步或起步困難等［18-19］。這提示，DigiGait 成像系統能有效檢測6-OHDA 誘導的PD 模型大鼠的步行功能障礙，同時也可作為PD 模型大鼠訓練干預后的評價指標，為PD 運動癥狀的臨床基礎研究提供可靠的行為學研究參數。

3.2 DigiGait 成像系統可反映PD 模型大鼠平衡與協調功能的退化情況

平衡、協調功能障礙是PD 常見的運動癥狀之一，DigiGait 成像系統通過特有的步態對稱性和腳爪放置定位指標來評價模型的協調功能及平衡功能。本研究結果顯示，PD模型大鼠在運動過程中出現跌倒或步態不穩等現象，但未達到單側脊髓損傷后完全癱瘓的程度［20-22］。DigiGait 成像系統顯示，PD 模型大鼠的協調、平衡功能均下降，觸地寬度增加，這與PD 大鼠出現因自動姿勢反應調整不及時（肢體肌力下降、前庭功能減退、本體感覺缺失等因素）導致的重心不穩、軀體前傾、肢體搖擺等表現一致［23］。單側腦注射6-OHDA［24］所制備的PD 模型具有臨床上PD 患者所出現的運動遲緩、運動控制能力下降等問題，并且左右側肢體癥狀比較更明顯，更利于研究者觀察分析。這提示，DigiGait 成像系統所特有的協調及平衡功能檢測指標可以更科學、簡便地評價PD 模型大鼠的協調、平衡功能，以彌補PD動物實驗中評價行為學整體表現的不足。

3.3 DigiGait 成像系統可應用于PD 模型大鼠的行為學研究

隨著病程的延長，PD 患者逐漸出現跌倒等癥狀，此時藥物治療效果不顯著且病情逐漸不可逆，因此非藥物干預（如早期康復治療手段）成為改善PD患者臨床癥狀的關鍵。運動干預、神經調控技術等作為典型的非藥物治療手段能有效改善機體運動功能及神經可塑性［25-26］，從而進一步激活相應感覺運動腦區，促進肌肉本體感覺的恢復，進而增強肌肉力量，逐步恢復運動控制能力，提升平衡、協調功能以達到改善PD 運動癥狀的目的。但在目前針對PD 的基礎研究中，尚缺乏能多維度評價治療效果的行為學檢測方法。本研究結果顯示，DigiGait成像系統能高效、準確地反映PD 模型大鼠運動功能的變化情況。因此，課題組認為可以運用Digi-Gait 成像系統的檢測優勢開展多種研究：①篩選改善PD 模型大鼠行為學的有效干預方法；②針對同一干預方法，設立不同的檢測時間節點進行周期性運動監測，篩選改善PD 模型大鼠行為學的最佳干預周期；③DigiGait 成像系統能在形態學、影像學、分子生物學等檢測手段的基礎上提供更為直觀的行為學檢測數據，更好地反映PD 治療新技術的臨床療效。

4 小 結

DigiGait 成像系統可以從空間子成分、時間子成分、姿勢子成分等3個維度客觀評價PD 模型大鼠步行功能、平衡功能及協調功能，在PD 相關基礎研究中具有廣泛的應用潛力。