殼聚糖含量的測定研究

江燕

(廣東省城市技師學院 廣東廣州 510000)

殼聚糖是一種白色無定形、半透明、略帶珍珠色的固體。由于原料不同，制備方法不同，相對分子量從幾十萬到幾百萬不等。殼聚糖及其衍生物無毒、無害，具有較好的保濕性、滲透性、電解性、降解性、吸附性、吸濕性，使其在農業、食品工業、水處理、紡織、化工、化妝品等領域均有廣泛的應用。此外，殼聚糖具有抗菌、殺菌、抗腫瘤、增強免疫力、促進組織修復及止血等生物活性，使其在醫藥方面具有廣泛的應用前景。因此，建立殼聚糖的定量分析方法尤為重要。

目前，國內、外殼聚糖的含量測定方法主要有電化學法、分光光度法、高效液相色譜法、滴定分析法、紅外光譜法等。受國內實驗條件的限制以及沒有殼聚糖純品，殼聚糖含量的測定仍采用間接測定為主，即先將殼聚糖水解成氨基葡萄糖，再用HPLC-折光測定法或分光度法對單糖定量。該文利用超聲波具有空化作用、機械力和熱效應作用，用于輔助酸水解殼聚糖生成D-氨基葡萄糖，在堿性條件下與乙酰丙酮反應生成吡咯，然后與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反應生成紅色化合物，在波長525 nm 處測定，在標準系列的葡萄糖鹽酸質量作為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標的工作曲線上查得對應的氨基葡萄糖質量，從而間接測定殼聚糖的含量[1]。

1 材料

1.1 材料與試劑

材料：殼聚糖。試劑：鹽酸、硫酸、冰乙酸、無水碳酸鈉、乙酰丙酮、無水乙醇、4-（二甲氨基）苯甲醛，均為AR。

1.2 儀器與設備

電子天平、水浴恒溫振蕩器、超聲波清洗器、電熱恒溫鼓風干燥箱、可見分光光度計。

2 方法

2.1 溶液的配制

乙酰丙酮溶液：準確吸取乙酰丙酮2.00 mL，加入1 moL/L碳酸鈉溶液至50 mL，置冰箱中備用，應于使用前一日配制。

對二甲氨基苯甲醛溶液：稱取4-（二甲氨基）苯甲醛0.8 g，加無水乙醇15 mL及鹽酸15 mL，搖勻。

氨基葡萄糖酸的標準溶液：在105 ℃干燥至0.050 0 g氨基葡萄糖酸在50 mL 容量瓶中，溶于水并稀釋成水垢，搖勻，去除2 mL，置于100 mL 容量瓶中，加水至水垢中，搖勻。

殼聚糖溶液：稱取60 ℃干燥至恒重的殼聚糖0.5 g（準確至0.000 2 g），加入1%的醋酸溶液，待其完全溶解后，定容于100 mL容量瓶中。

2.2 水解殼聚糖

取10 mL 比色管，依次準確地吸取殼聚糖溶液1.00 mL，分別加入一定濃度、體積的鹽酸和硫酸，混勻，置于沸水中水浴一段時間，一定溫度下超聲一段時間，取出冷卻至室溫，把溶液轉移至100 mL容量瓶中，用飽和碳酸鈉溶液調節pH 為7.2～7.5，用蒸餾水定量刻度，搖勻，放到一邊。

2.3 鹽酸氨基葡萄糖標準曲線的繪制

分別移取鹽酸氨基葡萄糖的標準溶液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL置于10 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至5.00 mL，分別加入乙酰丙酮溶液1.00 mL，搖勻，置于90 ℃水浴靜置25 min，取出，迅速用流動水冷卻，加入無水乙醇3.00 mL，于60 ℃水浴靜置10 min后，再加入對二氨基苯甲醛溶液1.00 mL，用力搖勻后，于60 ℃水浴靜置60 min，取出立即用冷水冷卻至室溫，在波長525 nm處，用1 cm比色皿，以試劑空白為參比液，測其吸光度值。工作曲線以標準系列鹽酸氨基葡萄糖為水平坐標，吸光度值為垂直坐標。

2.4 殼聚糖含量的測定

移取殼聚糖水解溶液1.00 mL 置于比色管中，按2.3的步驟測定其吸光度值。

以質量分數表示殼聚糖含量ω1，按公式（1）計算：

式（1）中：m1為由工作曲線查得的鹽酸氨基葡萄糖的質量，單位為mg；m為用于測定吸光度的殼聚糖質量，單位為mg；0.746 6 為鹽酸氨基葡萄糖折算為殼聚糖的系數。

公式（1）是以鹽酸氨基葡萄糖折算為殼聚糖的系數計算殼聚糖含量。

2.5 產率的計算

產率按以下（2）公式計算：

式（2）中：m1為由工作曲線查得的鹽酸氨基葡萄糖的質量，單位為mg；M1為鹽酸氨基葡萄糖的相對分子質量；m2為用于測定吸光度的殼聚糖質量，單位為mg；M2為殼聚糖的相對分子質量[2]。

3 結果與分析

3.1 鹽酸氨基葡萄糖-吸光度標準曲線

在波長525 nm處測定吸光度值，以鹽酸氨基葡萄糖質量m為橫坐標，單位為mg，對應的吸光度A為縱坐標，繪制鹽酸氨基葡萄糖～吸光度標準曲線，得回歸方程為A=6.0171m+0.0081，相關系數R2=0.9991。

3.2 水解條件的選擇

3.2.1 樣品量對殼聚糖含量測定的影響

分別吸取3.00 mg/mL、5.00 mg/mL、7.00 mg/mL、10.00 mg/mL、15.00 mg/mL的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L 鹽酸0.80 mL，75%硫酸3.50 mL，搖勻，置于沸水中水浴25 min，取出，置于50 ℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調節至pH為7.2～7.5，把溶液定容轉移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量。結果顯示樣品量為5.00 mg時測定殼聚糖含量最高，隨著樣品量的增加，水解程度逐漸降低。

3.2.2 水浴時間對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L鹽酸0.80 mL、75%硫酸3.50 mL，搖勻，分別在沸水中水浴10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，取出，置于50℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調節至pH為7.2～7.5，把溶液定容轉移至100 mL 容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量[3]。

結果表明，在實驗條件下，隨著水浴時間延長，殼聚糖逐漸被水解，當水浴時間達到30 min時，測定的殼聚糖含量最高，隨后則有所下降。這是由于隨著時間延長，殼聚糖糖苷鍵逐漸被打斷，但在濃酸和長時間高溫水解情況下，會出現焦化現象，導致氨基葡萄糖產率下降。

3.2.3 鹽酸用量對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL的殼聚糖溶液1.00 mL，分別加入0.168 mol/L 鹽酸0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL，75%硫酸3.50 mL，搖勻，置于沸水中水浴30 min，取出，置于50 ℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調節至pH 為7.2～7.5，把溶液定容轉移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量。

從試驗結果可看出鹽酸用量為0.80 mL 殼聚糖含量最高，隨著鹽酸用量的增加殼聚糖含量顯著下降。

3.2.4 硫酸濃度對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L 鹽酸0.80 mL，分別加入65%、70%、75%、80%、85%的硫酸3.50 mL，搖勻，沸水浴30 min，取出，置于50 ℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調節至pH 為7.2～7.5，把溶液定容轉移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量[4]。

硫酸濃度越高反應越充分，但同時也伴隨副反應的發生，水解產物的碳化也越嚴重，當硫酸濃度達85%時，溶液呈現為棕褐色，所以選擇濃度為70%的硫酸。

3.2.5 硫酸用量對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L鹽酸0.80 mL，分別加入75%的硫酸2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL搖勻，沸水浴30 min，取出，置于50 ℃超聲60 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調節至pH 為7.2～7.5，把溶液定容轉移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量。

硫酸用量過少，則體系粘度大，易引起局部焦化且反應不充分；如果用量過高，會給后處理調節pH 值帶來困難，綜合考慮，硫酸用量為4.00 mL較合適。

3.2.6 超聲時間對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L鹽酸0.80 mL，分別加入75%的硫酸4.00 mL，搖勻，沸水浴30 min，取出，50 ℃分別超聲10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60min、70 min、80 min、90 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調節至pH為7.2～7.5，把溶液定容轉移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量，結果證明超聲時間為70 min 測定殼聚糖含量最高。

3.2.7 超聲溫度對殼聚糖含量測定的影響

各吸取5.00 mg/mL 的殼聚糖溶液1.00 mL，加入0.168 mol/L鹽酸0.80 mL，分別加入75%的硫酸4.00 mL搖勻，沸水浴30 min，取出，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃條件下超聲70 min，自然冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液調節至pH 為7.2～7.5，把溶液定容轉移至100 mL容量瓶中，取1.00 mL測定殼聚糖含量[5]。

結果證明：提高超聲溫度略能提高水解反應的速率，但效果不明顯；當超聲溫度超過50 ℃，反而減弱了超聲在樣品水解中的促進作用。

3.3 殼聚糖含量的測定

采用正交試驗得到的優組合條件進行6次平行驗證試驗，結果測得殼聚糖含量的均值為76.804%，較單因素試驗中測得的殼聚糖含量低。分析是由于正交試驗所得的最優條件組合只是所選因素及其所取水平范圍內得到的結論，這樣的條件就所考查的因素和水平而言，可視為最佳條件；但影響殼聚糖含量測定結果的因素較多，并未全部納入正交試驗中進行考察，因此采用單因素試驗中的最優條件：樣品量2.00 mg，0.168 mol/L 鹽酸0.80 mL，75%硫酸3.50 mL，沸水浴30 min，50 ℃超聲60 min進行平行驗證實驗[6]。

該試驗測得的殼聚糖含量為82.89%，產率達83.13%，產率較高，其具體情況如表1所示。

表1 平行驗證試驗（單位：%）

4 結語

該文通過考察樣品量、鹽酸用量、硫酸用量、硫酸濃度、水浴時間、超聲時間、超聲溫度等因素對殼聚糖水解的影響，確定了適宜的水解條件及工作曲線，并且進行了樣品中殼聚糖含量、精密度及加標回收率的測定。試驗得到的最佳測定條件為：樣品量為2 mg，0.168 mol/L 鹽酸用量0.8 mL，75%硫酸用量3.5 mL，沸水浴30 min，50 ℃超聲60 min，測定的殼聚糖含量達82.89%，精密度為1.21%，平均回收率為97.7%。同時，通過實驗證明采用超聲輔助酸水解殼聚糖的測定結果明顯高于只用酸水解的測定結果，表明超聲波對酸水解殼聚糖有明顯的促進作用。試驗結果證明，該方法操作簡單，測定的準確性和精密度高，采用超聲波輔助酸水解殼聚糖具有減少硫酸用量、縮短水浴時間、提高產量等優點，適用于殼聚糖含量的測定。