介孔硼硅酸鹽玻璃微球藥物載體的制備及其性能表征

龐力斌, 王德平

介孔硼硅酸鹽玻璃微球藥物載體的制備及其性能表征

龐力斌, 王德平

(同濟大學 材料科學與工程學院, 上海 201804)

介孔二氧化硅微粒具有化學穩定性好、比表面積大和表面易修飾等特點, 作為藥物載體具有良好的應用前景, 但其缺乏生物活性且生物降解緩慢等在一定程度上限制了它的應用領域。為克服這些缺陷, 尋找合適的藥物載體已成為重要研究方向。與純二氧化硅相比, 硼硅酸鹽玻璃具有良好的生物活性和更高的降解速率。基于此, 本研究嘗試合成介孔硼硅酸鹽玻璃微球(MBGMs), 并表征了其在負載和釋放抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素(DOX)過程中的載體特性和材料降解引發的各種功能性離子的釋放行為。結果表明BMGMs具有約25 mg/g的DOX負載量,引入硼不僅可以調控MBGMs的化學活性和降解速率, 而且較高硼含量的MBGMs可促進酸性條件下的藥物釋放, 具有一定的酸性響應性。此外, MBGMs可在模擬體液中釋放SiO44–、BO33–和Ca2+等有益骨組織生長的功能性離子, 并誘導生成羥基磷灰石, 具備良好的離子緩釋能力和體外礦化活性。因此, MBGMs作為一種新穎的藥物載體材料, 既可作為藥物和功能離子的雙重負載, 又具有良好的生物活性和降解特性, 在病理性骨缺損修復領域具有良好的應用前景。

藥物載體; 硼硅酸鹽玻璃; 酸性響應性; 生物活性材料

硼硅酸鹽生物玻璃是在二氧化硅網絡中引入B、Ca、P等組分制成的一種生物活性玻璃, 硼硅酸鹽生物玻璃具有良好的生物相容性, 通過調節化學組成可以調控生物活性和降解速率, 同時釋放對組織損傷修復有益的離子(SiO44–、BO33–、Ca2+等), 促進干細胞的增殖和分化, 在骨組織工程領域已引起廣泛關注[6-7], 但其作為藥物載體的研究尚未見相關報道。

眾所周知, 在二氧化硅的玻璃網絡中添加適量的其它網絡形成體, 例如B元素, 即可有效調節玻璃的微觀結構和性能。因此, 若將硼硅酸鹽玻璃作為藥物載體, 則不僅具有相當于介孔二氧化硅顆粒的藥物負載功能, 而且有望實現可控的降解速率。此外, 若在玻璃網絡結構中引入各種有益的元素(Ca、Sr、Cu等), 還可具有成骨和成血管等功能[8], 在病理性骨缺損修復治療中發揮積極的輔助治療作用, 因而具有較高的應用價值[9-10]。

本研究合成了不同B含量的介孔硼硅酸鹽玻璃微球(MBGMs), 并對其理化性質進行了表征; 通過測定其負載抗癌藥物阿霉素(DOX)的載藥量和釋放曲線, 評價了該藥物載體的應用潛力; 通過體外測定SiO44–、BO33–、Ca2+等離子濃度變化而研究其離子釋放行為, 評估其作為組織修復材料的體外生物礦化活性; 最后, 討論了MBGMs作為一類新穎的藥物載體在藥物緩釋和離子遞送等方面的積極作用和在骨修復領域中的應用前景。

1 實驗方法

1.1 材料

研究所用的化學試劑, 包括硅酸四乙酯(TEOS)、氨水(NH4OH, 25%)、硼酸三丁酯(TBB)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和無水乙醇(≥99.7%)均為分析純, 購自國藥集團化學試劑有限公司。鹽酸阿霉素(DOX)購自酷爾化學科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 介孔硼硅酸鹽玻璃微球的合成

本研究制備了具有不同B2O3摩爾含量(0、10%、20%和40%)的MBGMs, 并將其分別命名為MBGMs-0B、MBGMs-10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B, 所設計的MBGMs的化學組分如表1所示。

采用改進的St?ber方法[11]制備: 首先, 將0.175 g CTAB和一定量的TEOS (MBGMS-0B、MBGMs- 10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B分別為3.0、2.2、1.6和0.7 mL)加入到含有80 mL去離子水和40 mL無水乙醇的溶液中, 然后在40 ℃恒溫磁力攪拌下將1 mL氨水加入上述溶液中, 用于引發TEOS的水解和聚合反應。攪拌10 min后, 先后逐滴加入一定量的TBB (MBGMS-0B、MBGMs-10B、MBGMs- 20B和MBGMs-40B分別為0、1.1、1.9和3.3 mL)和一定量的TEP (MBGMS-0B、MBGMs10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B分別為0.30、0.27、0.25和0.21 mL)。攪拌30 min后, 再加入一定量的CN(MBGMS-0B、MBGMs-10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B分別為1.9、1.7、1.5和1.3 g), 并繼續攪拌3 h。然后經4000 r/min離心5 min將得到的顆粒分離出來, 用去離子水洗滌3次后, 在60 ℃下干燥過夜。最后將顆粒在600 ℃下燒結4 h (加熱速率: 1 ℃/min)后即可得到不同B2O3含量的MBGMs微球。

本文在分析中國京津冀、長三角和珠三角城市群城鎮居民生活電力消費趨勢的基礎上，運用STIRPAT模型分析了三大城市群城鎮居民生活電力消費的影響因素，認為京津冀城市群城鎮居民用電呈現“產業結構主導型”模式，長三角城市群城鎮居民用電呈現“人口主導型”模式，珠三角城市群城鎮居民用電呈現“收入主導型”模式。依據三大城市群各有特色的城鎮居民生活用電模式，為推動城鎮居民生活能源消費結構優化，促進各城市群，提出如下建議:

1.2.2 MBGMs表征

通過透射電子顯微鏡(TEM, Joel JEM-2100F)和能譜儀(EDS, Joel JEM-2100F)、掃描電子顯微鏡(SEM, FEI Quanta 200F)和X射線衍射(XRD, Rigaku D/max2550)對MBGMs的微觀形貌和物相進行表征。通過氮吸附和解吸測試分析MBGMs的結構特征(NOVA 2200e, Quantachrome Autosorb)。

表1 MBGMs的設計摩爾組成

為評估MBGMs的體外礦化活性, 將MBGMs微球浸泡在模擬體液(SBF)中一定時間后, 通過SEM和XRD觀察和分析羥基磷灰石(HA)的生成。此外, 通過電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES, PerkinElmer Optima 8300)研究MBGMs在磷酸鹽緩沖鹽液(PBS)中的降解速率和離子釋放行為。具體過程為: 將10 mg MBGMs微球浸泡在10 mL PBS溶液中, 每天取出5 mL PBS溶液分析所含的各種離子濃度, 同時將5 mL新鮮PBS補充到浸泡液中。所有實驗均重復3次(=3)。

1.2.3 載藥量和釋放曲線測定

抗癌藥物DOX的負載實驗過程如下: 將0.4 g MBGMs分散在20 mL的0.5 mg/mL DOX溶液中攪拌12 h, 然后以8000 r/min的速度離心10 min, 收集上清液用于測試DOX濃度, 同時收集MBGMs顆粒,用去離子水洗滌并干燥24 h (=3)。所得顆粒命名為MBGMs@DOX。DOX負載量()根據下式計算:

其中,0為原DOX溶液濃度(0.5 mg/mL),1為離心后上清液中DOX濃度,為DOX溶液體積(20 mL),為MBGMs顆粒質量(為最大理論載藥量, 未將洗滌過程的損失計算在內)。

DOX的釋放曲線按如下方法測定: 通過攪拌和超聲將15 mg MBGMs@DOX分散在2 mL不同pH的PBS緩沖液中。然后, 將2 mL分散液加入預處理的透析袋中(截留分子量為7000 Da)后, 將透析袋密封并浸入18 mL pH相同的緩沖液中, 放入37 ℃恒溫振蕩器中以100 r/min的速度振蕩。在預先設定的時間點, 取出4 mL浸泡液測試DOX濃度, 同時將4 mL新鮮緩沖液補充到浸泡液中(=3)。釋放的DOX的質量()按下式計算:

其中,為釋放的DOX總量,C為第次所取浸泡液的DOX濃度,為緩沖液體積(20 mL),0為每次所取浸泡液體積(4 mL)。

通過紫外–可見吸收光譜儀測試DOX溶液的濃度。實驗前配置了一系列不同DOX濃度的標準溶液, 并繪制了吸光度–DOX濃度標準曲線, 然后通過該標準曲線來確定DOX濃度。

2 結果與討論

圖1顯示了MBGMs微球的TEM照片, 表明改進的St?ber法成功合成了直徑約400 nm的單分散介孔微球。表2是根據能譜分析(EDS)結果所計算得到的MBGMs的實際組成, 結果顯示MBGMs的組成呈現硼含量梯度變化趨勢。圖2(A～D)是MBGMs微球的SEM照片, 與TEM照片相似, 都顯示實驗成功制備了粒徑約400 nm的單分散微球。所制備的微球XRD圖譜(圖3(A))顯示, 4種MBGMs均為無定形材料。可見, 本研究成功合成了單分散、無定形的介孔硼硅酸鹽玻璃微球。

為了評估MBGMs的體外礦化活性, 將MBGMs微球浸泡于SBF模擬體液(pH 7.4)中觀察磷灰石的生成情況。SEM照片表明浸泡3 d后MBGNs微球的表面變得粗糙(圖2(A1～D1)), 有礦物沉積, XRD結果證實了該礦物為羥基磷灰石(圖3(B))。礦化結果表明MBGMs可以誘導羥基磷灰石生成, 具有良好的體外生物活性, 在骨缺損修復和再生領域具有良好的應用潛力[12-13]。

圖1 MBGMs的TEM照片

(A) MBGMs-0B; (B) MBGMs-10B; (C) MBGMs-20B; (D) MBGMs-40B

表2 根據EDS能譜所計算的摩爾MBGMs組成

圖2 MBGMs在SBF中浸泡3 d前(A～D)和后(A1～D1)的SEM照片

(A, A1) MBGMs-0B; (B, B1) MBGMs-10B; (C, C1) MBGMs-20B; (D, D1) MBGMs-40B

圖3 MBGMs在SBF中浸泡3 d前(A)后(B)的XRD圖譜

圖4 MBGMs氮氣吸附/解吸附等溫線(A)、MBGMs在pH=5的PBS中浸泡3 d前(B)和后(C)的孔徑分布

根據氮吸附/解吸附結果, 由BET理論計算MBGMs-0B、MBGMs-10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B四種MBGMs微球的比表面積分別為259、231、221和212 m2/g。此外, 四種MBGMs的等溫線表現為IV型等溫線, 回滯環的形狀表明MBGMs為具有窄孔徑分布的介孔材料(圖4(A)), 孔徑分布集中在4 nm左右(圖4(B)), 以上結果表明MBGMs具有較高的比表面積和較窄的孔徑分布, 是一種潛在的藥物載體。MBGMs在PBS溶液(pH 5)中浸泡3 d后的孔徑分布如圖4(C)所示, 浸泡后微球孔徑分布發生變化, 孔徑逐漸變大, 而且孔徑增大的程度與B2O3含量有關。B2O3含量越高, 孔徑增大的程度越大, 其中MBGMs-40B的孔徑變化范圍最大。這是由于引入硼降低了玻璃結構的致密性和玻璃抵抗酸腐蝕的能力, 在酸性條件下, 微球的微觀結構更容易被破壞, 導致孔徑更容易擴大。

為了研究MBGMs的降解和離子釋放行為, 通過ICP-OES測定了各種離子在PBS浸泡液中的濃度。結果表明MBGMs可以釋放多種離子到浸泡液中(圖5)。而且隨著硼含量增大, 降解速率逐漸增大, 其中MBGMs-40B的化學活性最高, 降解最快。在所有MBGMs中, SiO44–、BO33–和Ca2+離子都可有效釋放, 表明MBGMs除了可作為載體緩釋藥物, 還可緩釋SiO44–、BO33–和Ca2+等功能性離子, 促進骨組織再生的生物學功能[14-15]。

為了驗證MBGMs作為藥物載體的可行性, 本實驗首先測試了MBGMs負載抗癌藥物DOX的負載量。根據測試結果計算的MBGMs-0B、MBGMs- 10B、MBGMs-20B和MBGMs-40B的DOX負載量分別為(24.85±0.50)、(24.80±0.53)、(24.53±0.64)和(24.50±0.71) mg(DOX)/g(MBGMs)。DOX釋放曲線(圖6)顯示, MBGMs@DOX可以將DOX有效釋放到模擬體液中。4種微球7 d的藥物釋放量均未超過40%, 可能是受到藥物釋放機理的限制, 因為藥物主要通過物理吸附作用負載并利用濃度差擴散, 其釋放量在體積有限的溶液中達到相對平衡, 表現為后期釋放相對平緩, 尤其是在酸性條件下, 微球被侵蝕和降解, 導致結構變得疏松多孔, 對藥物的吸附作用增強, 會更早達到平衡值。其中MBGMs- 0B@DOX和MBGMs-10B@DOX在酸性條件下(pH 5)釋放的藥物比在生理模擬條件下(pH 7.4)釋放的藥物少, 而MBGMs-20B@DOX和MBGMs- 40B@DOX在酸性條件下釋放的藥物比在偏堿性條件下更多更快, 表現出一定的酸性響應性釋放, 這對骨髓炎以及骨腫瘤等病理微環境通常為酸性的病變區域來說, 其藥物遞送具有積極意義[16-17]。

圖5 MBGMs在PBS中降解釋放Si(A)、B(B)和Ca(C)離子的釋放曲線

圖6 MBGMs@DOX在不同pH的PBS中的DOX釋放曲線

(A) MBGMs-0B@DOX; (B) MBGMs-10B@DOX; (C) MBGMs-20B@DOX; (D) MBGMs-40B@DOX

對于較低和無B含量的樣品, 酸性條件的藥物釋放慢于生理環境, 其原因推測如下: 在偏堿性的生理條件下, 微球中的Si會與OH–發生反應, 微球發生降解, 導致較高的藥物釋放量; 而B含量較低時, 微球穩定性也較高, 微球抗酸腐蝕能力較強, 造成微球在酸性條件下降解較慢, 藥物僅憑濃度差進行擴散釋放。這兩方面的作用導致MBGMs- 0B@DOX和MBGMs-10B@DOX在酸性條件下藥物釋放量低于生理環境。

隨著硼含量增大, MBGMs微球的化學穩定性逐漸降低, 抗酸腐蝕能力下降, 微球更容易降解(圖5),導致MBGMs-20B@DOX和MBGMs-40B@ DOX在酸性條件下的藥物釋放比較高。而這與MBGMs-20B和MBGMs-40B在酸性條件下孔徑會進一步擴大的結果一致, 其中在酸性PBS中浸泡3 d后, MBGMs的孔徑普遍變大, 孔徑變化程度依次為MBGMs-40B> MBGMs-20B>MBGMs-10B>MBGMs- 0B(圖4(C))。

MBGMs活性的提高主要是由于引入B降低了二氧化硅網絡的穩定性, 因為B2O3-SiO2玻璃由[BO3]三角體和[SiO4]四面體兩種結構單元組成, 而[BO3]三角體會形成二維平面結構, 破壞[SiO4]四面體所形成的三維立體網絡結構[18]。此外, 引入其他成分如P2O5和CaO也可以進一步調節B2O3-SiO2玻璃的穩定性[19]。因此, 與純二氧化硅或硅酸鹽玻璃相比, 本研究合成的B2O3-SiO2-P2O5-CaO硼硅酸鹽玻璃微球具有更高的降解速率。正是由于硼硅酸鹽玻璃更高的降解速率和組成的可調控性, 可以釋放多種功能性離子, 用于遞送各種有益離子促進組織與細胞的增殖與分化[15,20]。

3 結論

本研究使用改進的St?ber方法成功合成了具有不同B含量單分散的MBGMs。MBGMs具有約400 nm的粒徑、狹窄的孔徑分布(孔徑集中在4 nm左右)和較高的比表面積等特性; 可有效負載抗癌藥物DOX, 負載量約為25 mg(DOX)/g(MBGMs)。引入B可調控MBGMs的化學活性和降解速率, 特別是B含量較高的MBGMs (MBGMs-20B和MBGMs-40)B能夠在偏酸性的環境下更多更快地釋放DOX, 其藥物釋放行為表現出一定的酸性響應性。同時MBGMs具有較高的降解活性和組成可調控性, 除了作為SiO44–、BO33–和Ca2+等功能性離子的遞送載體, 還具有較高的生物活性, 在模擬體液中能夠誘導羥基磷灰石生成, 具有良好的體外礦化活性。綜上, 本研究制備的MBGMs具有作為藥物和離子的遞送載體, 以及生物活性骨修復材料的潛力, 在病理性骨缺損修復領域具有應用潛力。

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Drug Carrier Based on Mesoporous Borosilicate Glass Microspheres: Preparation and Performance

PANG Libin, WANG Deping

(School of Materials Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 201804, China)

Mesoporous silica particles have characteristics of excellent chemical stability, large specific surface area and convenient surface modification, showing promising application in drug carriers. However, their lack of bioactivity and slow biodegradation rate limit this application. To overcome these shortcomings, creating suitable biomaterials for drug carriers has become an indispensable and, therefore, important research direction in materials science. Compared with pure silica or silicate glasses, borosilicate glasses with excellent bioactivity degrade faster, enabling them suitable and favorable for drug carriers. Here, we synthesized mesoporous borosilicate glass microspheres (MBGMs) and characterized their properties of loading and releasing an antitumor drug, doxorubicin hydrochloride (DOX), and releasing their own various ions triggered by degradation. The results showed that BMGMs had a DOX loading amount of about 25 mg/g. Introduction of boron improved chemical activity and degrading rate of MBGMs, resulting in more DOX released in acidic enviroment than alkaline condition, which displayed a certain acid-responsive drug releasing behavior. Meanwhile, MBGMs can release functional ions such as SiO44–, BO33–and Ca2+, and induce hydroxyapatite formation, indicating sustained ion releasing ability and excellent bioactivity. Altogether, MBGMs, as a novel kind of drug carrier, have a potential application in the field of pathological bone defect repairing.

drug carrier; borosilicate glass; acid sensibility; bioactive material

1000-324X(2022)07-0780-07

10.15541/jim20210621

TQ174

A

2021-10-07;

2021-11-24;

2021-12-16

國家自然科學基金(51772210); 國家重點研發計劃(2018YFC1106302)

National Natural Science Foundation of China (51772210); National Key R&D Program of China (2018YFC1106302)

龐力斌(1997–), 男, 博士研究生. E-mail: panglibin@foxmail.com

PANG Libin (1997–), male, PhD candidate. E-mail: panglibin@foxmail.com

王德平, 教授. E-mail: wdpshk@tongji.edu.cn

WANG Deping, professor. E-mail: wdpshk@tongji.edu.cn