石榴皮、金銀花、牡丹復配物體外抗氧化作用評價*

王 榮，秦 蘭,2，王娜娜，張德柱，王曉茹，秦 蓓,2

(1 西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021；2 成都醫學院藥學院，四川 成都 610500；3 陜西盤龍藥業集團股份有限公司， 陜西 西安 710025；4 陜西功能食品工程中心有限公司，陜西 西安 710065)

自由基別名游離基，是人體正常代謝的中間產物，具有強氧化性。自由基作為具有不成對電子的原子或基團，會奪取其他細胞的電子來維持自身的穩定性，當體內的自由基團過多時，人體的動態平衡會被打破，從而造成一系列細胞損傷反應，進而引起多種疾病的產生[1]，因此研究和開發抗氧化物質已經成為國內外醫藥學研究熱點。對于抗氧化產物的研究，從天然植物中可以提取出黃酮[2]、多酚[3]、皂苷[4]、生物堿[5]等多種抗氧化活性物質，它們具有安全無毒的特點，可以用來制備抗氧化劑。據研究將抗氧化活性成分進行復配之后的活性遠比單一抗氧化劑的活性效要高[6]，因此本實驗采用石榴皮、金銀花、牡丹作為原材料，提取其中的沒食子酸、綠原酸、丹皮酚[7]來進行抗氧化產物的復配研究。

在抗氧化產物配制研究之后，評價其具有的活性大小對于抗氧化的研究具有十分重大的意義。當前對抗氧化物質的體外抗氧化活性評價方法主要有自由基清除法，脂質過氧化抑制法等[8]。本實驗則基于酶標儀-微孔板，建立DPPH自由基清除、ABTS 自由基清除和紅細胞氧化損傷模型三個方面驗證此復配產物的體外抗氧化活性能力大小。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

沒食子酸-綠原酸-丹皮酚(1∶1∶1)復配物，自制；維生素C(Vc)標準品(HPLC≥99%)；DPPH標準品(HPLC≥98%)，ABTS(純度98%)，ABTS標準品(純度99%)，上海源葉生物科技有限公司；MDA檢測試劑盒(批號：2021032)，SOD測定試劑盒(20210325)，GSH測定試劑盒(20210323)，蛋白定量測定試劑盒(20210324)，南京建成生物工程研究所；氯化鈉注射(500 mL∶4.5 g)，辰欣藥業股份有限公司。

1.2 儀 器

SQP QUINTIX24-1CN型電子分析天平，德國賽多利斯公司；1510型自動全波長酶標儀，Thermo Scientific公司；SB-5200DT超聲波清洗機，寧波新芝生物科技公司；VM-02U渦旋儀,SilentShake公司；202-1AB型電熱恒溫干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；PR-I-5T型超純水機，四川優普科技有限公司；TGL-16G高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

2 方 法

2.1 DPPH自由基清除能力測定

避光稱取20 mg DPPH至250 mL容量瓶，無水乙醇定容稀釋獲0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.0025 mg/mL的系列溶液。酶標儀在517 nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制DPPH標準曲線。結果顯示DPPH在0.002～0.04 mg/mL濃度范圍內與吸光度呈現良好的線性關系，回歸方程為y=10.328x+0.1544，相關系數R2=0.9937。

精密稱取復配產物4.9 mg至250 mL容量瓶，無水乙醇定容稀釋使其濃度梯度為0.0196、0.0098、0.0049、0.00245、0.001225 mg/mL。精密吸取上述系列濃度與0.04 mg/mL DPPH溶液各100 μL作為實驗組，精密吸取上述系列濃度與無水乙醇各100 μL作為對照組，精密吸取0.04 mg/mL DPPH溶液和無水乙醇各100 μL為標準組。各組避光靜置反應30 min，517 nm測吸光度，計算清除率和IC50。同時設置Vc陽性對照組。

DPPH清除率=[1-(A實驗組-A對照組)/A標準組]×100%

2.2 ABTS自由基清除能力的測定

避光稱取ABTS自由基粉末32.4 mg，以雙蒸水為溶劑配制3.24 mg/mL的ABTS備用液。稱取K2S208粉末10.5 mg，雙蒸水溶解，得到0.7 mg/mL的K2S208備用液，將以上二種儲備液按體積比1∶1等量混合，得ABTS自由基母液，4 ℃ 冰箱保存10～12 h備用。

精密稱取復配產物1.4 mg至10 mL容量瓶，無水乙醇定容稀釋成濃度梯度為0.14、0.035、0.00875、0.0021875、00054688 mg/mL的溶液。精密吸取梯度復配產物溶液100 μL和稀釋后的ABTS自由基溶液100 μL為實驗組；精密吸取梯度復配產物100 μL和無水乙醇100 μL為對照組；精密吸取無水乙醇100 μL和稀釋后的ABTS自由基溶液100 μL為標準組，避光反應6 min，734 nm處測吸光度。Vc作為陽性對照，按上述公式計算清除率和IC50值。

2.3 復配產物對紅細胞氧化損傷的保護作用

2.3.1 紅細胞懸浮液的制備

大鼠抗凝血液，2500 r/min離心10 min，棄去上清，沉淀加生理鹽水洗滌三次，按體積比(1:99)向紅細胞中加入生理鹽水制成10%紅細胞懸浮液，4 ℃保存。

2.3.2 溶血率的測定

精密吸取10%紅細胞懸浮液100 μL和50 μL濃度梯度復配產物，37 ℃恒溫預培養30 min，加入 0.2 mg/mL的AAPH溶液100 μL，37 ℃培養4 h，同時設立正常組(紅細胞懸液+生理鹽水)和模型組(紅細胞懸液+生理鹽水+AAPH溶液)。上述紅細胞反應液分別加入1 mL 生理鹽水和1 mL預冷雙蒸水，3500 r/min下離心5 min，取上清液，在540 nm處測吸光度分別記為A、B。按公式計算溶血率。

溶血率=A/B×100%

2.3.3 紅細胞MDA含量及SOD和GSH-Px酶活測定

按2.3.1項下制備紅細胞懸浮液，按說明書操作檢測細胞內MDA含量、GSH-Px和SOD酶活力的改變。

2.4 數據統計與分析

使用SPSS軟件分析進行誤差處理，結果標記為平均值±標準差，顯著性差異的處理采用雙側t檢驗，其中P<0.05表明差異顯著，P>0.05表明無顯著差異。

3 結果與討論

3.1 復配產物對DPPH自由基清除能力測定

由表1和表2可知，Vc和復配產物對DPPH自由基的清除率與其濃度之間存在依賴性的關系。復配產物的IC50值約為0.065 mg/mL；Vc濃度為0.022 mg/mL時清除率便高達95.22%，其IC50值為0.064 mg/mL。本實驗中復配產物對DPPH自由基的清除能力與Vc無明顯性的差異(P>0.05)，說明復配產物有較好的自由基清除能力。

表1 復配產物濃度對DPPH自由基的清除率

表2 Vc對DPPH自由基的清除率

3.2 復配產物對ABTS自由基清除率測定

由表3可知，Vc在濃度為0.20 mg/mL時清除率就達99.77%，清除能力較強。由表4可知，復配產物對ABTS自由基的清除率有濃度依賴性。復配產物IC50值為0.13 mg/mL；Vc的IC50值為0.19 mg/mL。

表3 Vc對ABTS自由基的清除率

表4 復配產物對ABTS自由基的除率

3.3 復配產物對紅細胞溶血抑制作用

表4顯示，正常組、模型組、藥物組水浴加熱反應4 h后，對照組溶血率高達78.89%。與模型組相比，隨著復配產物濃度的逐漸升高，紅細胞溶血作用被抑制的程度也逐漸增大。在0.00125～0.1 mg/mL濃度之間復配產物對AAPH誘導的紅細胞溶血有極顯著抑制作用(P<0.01)。而當濃度稀釋為 0.00625 mg/mL時加入的復配產物對溶血的抑制作用十分微弱，紅細胞產生的溶血現象與模型組相比并無顯著差異 (P>0.05)。以上結果表明在0.1 mg/mL濃度時復配產物對溶血率的抑制保護作用最為有效。

表5 不同濃度復配產物復對紅細胞溶血抑制作用

3.4 復配產物對紅細胞MDA含量和抗氧化酶活力大小影響

由表6可得，正常組、模型組、藥物組水浴反應4 h后，模型組紅細胞內MDA含量約為15.67 mg/mL，相比于正常組MDA含量大約增加了15倍；與模型組相比，高、中濃度復配產物顯著降低MDA含量(P<0.01或P<0.05)。經AAPH損傷后的GSH-Px酶活力大小與正常組差異顯著(P<0.01)；與模型組相比，隨著復配產物濃度的升高，GSH-Px酶活力也隨之增高，高濃度組可顯著提高紅細胞GSH-Px酶活力(P<0.01)。經AAPH損傷后的SOD酶活力強度大小與正常組相比具有差異顯著(P<0.01)；與模型組相比，高濃度復配產物可顯著提高SOD酶活力(P<0.05)。

表6 不同濃度復配產物對AAPH損傷紅細胞內MDA含量

4 結 論

本實驗選取天然植物石榴皮、金銀花、牡丹為原材料，分別提取其中的沒食子酸、綠原酸、丹皮酚，利用協同藥理作用將三種抗氧化活性成分進行復配，復配具有可重復性，低成本，低毒等優點。

抗氧化產物的制備與其活性的評價是緊緊聯系的。目前抗氧化活性方法有很多，但要全面的評價抗氧化產物的活性必須采用兩種以上的方法進行評價[8-9]，本實驗則是建立微量 DPPH 自由基清除模型、ABTS 自由基清除模型和紅細胞氧化損傷模型研究復配產物的體外抗氧化活性能力大小。結果顯示此復配產物具有較強的體外抗氧化活性，可以有效的清除DPPH自由，ABTS自由基，并通過保護紅細胞內抗氧化酶系統和抑制脂質過氧化實現抗氧化作用。

綜上，本次實驗合成的復配產物具有較強體外抗氧化能力，在進行天然抗氧化劑的研究中我們取得了新的進展，可以進一步研究體內抗氧化活性大小最終進行抗氧化產品的開發，本次實驗我們選取的是操作簡單，可重復性高，反應終點明顯的三種體外抗氧化活性評價方法，在未來研究中我們可以進一步研究出更多的方法對抗氧化劑進行更加全面的科學評價。