DKK2基因啟動子甲基化及高危HPV感染在宮頸癌中的臨床意義*

張 嫻，武 玉，張 艷

(聊城市人民醫(yī)院婦科，山東 聊城 252000)

宮頸癌是全球最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增加，并呈現(xiàn)年輕化趨勢。早期宮頸癌治愈率較高，但晚期患者總生存率不令人滿意[1]。宮頸癌是目前唯一病因明確并有疫苗可進行預防的惡性腫瘤，其主要危險因素是高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續(xù)感染，以HPV16/18亞型致病性最強。HR-HPV持續(xù)感染發(fā)展為宮頸癌的時間為15～20年。目前，最常見的宮頸癌篩查方法是宮頸液基細胞學(TCT)檢查和HPV檢測，其中TCT成本較低，但受人為客觀因素的影響，容易導致誤診漏診，準確性較差[2]。HPV檢測技術可顯著提高細胞學的敏感性，目前細胞學和高危型HPV聯(lián)合檢測已成為宮頸癌篩查的策略之一[3]。但是，HPV檢測結果單一，不能提供腺體病變等額外信息，其在宮頸癌及癌前病變檢查中缺乏特異性。因此，迫切需要一種特異性的新型分子標志物對宮頸癌及癌前病變進行早期識別。近年來的研究表明，腫瘤相關基因的DNA甲基化和抑癌基因的表達與腫瘤的早期進展密切相關[4-7]。DNA甲基化是表觀遺傳學的主要表現(xiàn)形式。啟動子高甲基化是抑癌基因失活的一種重要機制，在某些情況下甚至是抑癌基因失活的唯一機制。抑癌基因啟動子區(qū)CpG島異常甲基化可改變基因的表達模式，導致抑癌基因的轉錄抑制或沉默。盡管啟動子甲基化導致的DKK2(Dickkopf2)基因沉默現(xiàn)象出現(xiàn)在人類多種癌癥中，但其在宮頸癌中的研究較少見。本研究探討了DKK2基因啟動子甲基化狀態(tài)及HR-HPV在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義，旨在為宮頸癌的早期防控提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年5月至2017年11月本院確診的79例宮頸癌患者(宮頸癌組)及63例宮頸癌前病變患者(癌前病變組)組織標本，其中高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)38例，低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)25例。同時選取29例子宮平滑肌瘤行子宮全切的患者作為對照組。所有患者均經(jīng)組織病理學證實，標本均在化療或放療前采集，所有標本保存于-80 ℃。排除妊娠、急慢性病毒感染、免疫缺陷疾病、合并其他惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者或家屬均知情同意。

1.2方法

1.2.1HPV基因分型 采集宮頸脫落細胞保存于采集瓶中，保存于4 ℃。標本采集前72 h禁止性行為、陰道用藥及沖洗。采用雜交捕獲法進行HPV篩查及基因分型。

1.2.2DNA的準備和亞硫酸鹽處理 按照DNA提取試劑盒(日本Takara公司)說明書從凍存組織中提取DNA樣本，并測定其純度和濃度。使用EZ-DNA甲基化試劑盒(美國Zymo Research公司)對1 μg基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，并按照試劑盒說明書進行純化。最終產(chǎn)物經(jīng)氫氧化鈉脫硫、乙醇沉淀后溶于20 μL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP) 使用MSP試劑盒檢測DKK2基因的甲基化狀態(tài)。DKK2基因啟動子甲基化和未甲基化形式的特異性引物被用于擴增特定區(qū)域[8]，甲基化分析所用引物及聚合酶鏈式反應(PCR)產(chǎn)物大小見表1，均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應條件：反應體積30 μL，95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火54 ℃或58 ℃ MSP 30 s，在72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳、溴化乙啶染色后在凝膠成像系統(tǒng)下可視化并記錄結果。僅將未甲基化引物的陽性擴增解釋為未甲基化，將甲基化引物或甲基化和未甲基化引物的正擴增視為甲基化。

表1 擴增引物序列

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確性檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.13組患者DKK2基因啟動子甲基化率比較 癌前病變組中HSIL患者DKK2基因啟動子甲基化率與宮頸癌組、對照組患者及癌前病變組中LSIL患者比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

續(xù)表2 3組患者DKK2基因啟動子甲基化率比較

2.23組患者HR-HPV感染率及感染者DKK2基因啟動子甲基化率比較 3組患者HR-HPV感染率及其DKK2基因啟動子甲基化率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。宮頸癌組中，HPV16/18陽性患者DKK2基因啟動子甲基化率高于非HPV16/18陽性患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。癌前病變組中，HPV16/18陽性患者DKK2基因啟動子甲基化率高于非HPV16/18陽性患者，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組患者HR-HPV感染率及感染者DKK2基因啟動子甲基化率比較

3 討 論

表觀遺傳學概念是由英國科學家Waddington在1942年首次提出，指的是非基因序列改變導致的表型變化，與細胞生長、分化、凋亡等生物學過程密切相關，并在生長發(fā)育和疾病發(fā)病機理研究中被廣泛應用[9]。表觀遺傳學的主要表現(xiàn)形式包括：DNA/RNA甲基化、組蛋白修飾、核小體定位、非編碼RNA、基因印記等。其中，DNA甲基化是目前研究較清楚的表觀遺傳修飾機制之一，指的是生物體在DNA甲基轉移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到特定的堿基上的過程，其能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。由此看出，DNA修飾在轉錄調(diào)節(jié)中起著關鍵作用，所以這一機制的缺陷可能導致包括癌癥在內(nèi)的各種疾病[10-11]。在癌癥發(fā)生時，抑癌基因啟動子區(qū)域表現(xiàn)為高甲基化，基因啟動子甲基化后，基因表達就會減弱甚至關閉。如腫瘤細胞中抑癌基因啟動子通常為高甲基化，抑制抑癌基因表達使其喪失抑癌功能，從而促進癌癥的發(fā)生，且多發(fā)生在癌癥的早期階段，因此基因啟動子甲基化程度的檢測可作為腫瘤發(fā)生發(fā)展的動態(tài)指標。目前，DNA甲基化在宮頸癌及宮頸病變中的研究較多，引入新的高效腫瘤生物標志物能夠降低手術切除率，可更好地預測腫瘤的發(fā)生情況。

Wnt通路是重要的細胞信號轉導通路，主要途徑有3條，其中Wnt/β-catenin信號通路為經(jīng)典通路，受多種分泌拮抗劑調(diào)控，在調(diào)控基因轉錄、細胞增殖、器官形成等生物學過程中發(fā)揮重要作用。β-catenin是一種重要的促癌蛋白，可與T細胞因子/淋巴增強因子轉錄因子相互作用，激活Wnt/β-catenin通路的靶基因，如c-MYC、Cyclin D1、MMP-2等，促進癌細胞的增殖、遷移、侵襲。一些基因作用于該通路的某些環(huán)節(jié)，抑制其過度激活，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。DNA甲基化是這些基因失活的重要機制。DKK是Wnt/β-catenin信號通路最常見的負調(diào)控因子，包含DKK1、DKK2、DKK3、DKK4共4個家族成員，均為具有2個由連接區(qū)分隔的富含半胱氨酸結構域的分泌蛋白。其中，DKK2位于染色體4q25位點，基因長度149 kb，編碼的蛋白約28 kD，可與低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6結合。作為典型的Wnt/β-catenin拮抗劑，DKK2啟動子中具有典型的CpG島。啟動子CpG甲基化受到表觀遺傳機制的調(diào)控，通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路，抑制腫瘤細胞增殖、分化失控[12]。啟動子甲基化導致的DKK2表觀遺傳沉默已在多種人類癌癥中被觀察到，如卵巢癌、結腸直腸癌、乳腺癌、口腔鱗癌和胃癌組織中存在著不同程度的甲基化及組織表達下調(diào)，同時有抑制腫瘤細胞生長、侵襲等生物學能力[13-17]，然而其確切的細胞功能尚不明確，其在宮頸癌中的功能及相關分子機制尚不清楚[18-19]。宮頸鱗癌患者DKK1基因啟動子甲基化與高危HPV感染、組織分化、腫瘤大小、淋巴結轉移和國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期有關，而DKK-1基因啟動子甲基化程度與高危HPV感染類型無關[20]。本研究檢測了DKK2啟動子在宮頸癌、癌前病變及正常宮頸組織中的甲基化狀態(tài)，結果顯示，51.9%的患者宮頸癌組織中DKK2啟動子為高甲基化狀態(tài)，而在正常宮頸組織中未發(fā)生甲基化，隨著宮頸病變的加重，DKK2基因啟動子甲基化呈上升趨勢，證實DKK2基因啟動子甲基化在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。在許多癌癥中，表觀遺傳學的改變導致CpG島啟動子區(qū)域甲基化，可導致DNA結合蛋白發(fā)生基因沉默，然后阻斷轉錄調(diào)節(jié)器，最終導致DKK2基因表達減少[21]。有研究顯示，用抗體阻斷DKK2可通過免疫細胞激活和腫瘤血管生成抑制腫瘤進展，提示抗DKK2和抗VEGFR的聯(lián)合可能是晚期結直腸癌的潛在治療方法[22]。

HPV感染占宮頸癌病例的90%以上，高危型HPV與87%～88%的鱗狀細胞癌相關。HPV感染可引導宿主細胞的遺傳和表觀遺傳學變化，最終導致宮頸癌[23-24]。本研究結果顯示，宮頸癌組、癌前病變組及對照組HR-HPV感染率分別為92.4%、82.5%、6.9%，具有明顯的差異，提示HR-HPV的篩查對宮頸癌及癌前病變的早期診斷具有極其重要的意義。降低和清除HPV對宮頸癌及癌前病變有良好的防治作用，但治療HPV感染目前尚無特效藥物。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變嚴重程度增加，DKK2基因啟動子甲基化的檢出率逐漸升高。在HR-HPV陽性宮頸癌患者中，HPV16/18陽性患者的DKK2基因啟動子甲基化率高于非HPV16/18陽性患者，但在癌前病變組中，二者無顯著差異，可能與樣本量小有關。隨著診斷技術的發(fā)展、細胞學檢查等技術的推廣，以及HPV病毒微量提取與雜交法的廣泛應用，宮頸癌發(fā)病率和病死率已明顯降低[25-27]。HPV感染者并不一定會發(fā)生癌前病變或?qū)m頸癌，在宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展過程中，可能存在其他協(xié)同因子的共同促進效應，因此基于基因水平的特異性檢測方法應運而生。基因甲基化分析是一種非形態(tài)學的分子檢測方法，可為HR-HPV陽性患者提供一種客觀、潛在的分流方法。對于癌前病變，HPV基因分型與甲基化標記物分析相結合，既可以避免細胞學檢查的局限性，又可以保證診斷的準確性。DNA甲基化的分流檢測可將宮頸癌高危患者和低危患者區(qū)分開來。

綜上所述，DKK2常因其啟動子高甲基化而失活，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關，可能是一種潛在的宮頸癌分子標志物。細胞基因組的表觀遺傳學變化在宮頸腫瘤的發(fā)生中很常見，在臨床和診斷研究中，腫瘤抑制基因的DNA甲基化可能是理想的分子生物學標記物。DKK2的表觀遺傳變化可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，DKK2基因啟動子的高甲基化可作為篩查、早期診斷、宮頸癌前病變分級管理及宮頸癌風險分層的重要手段，期待大樣本前瞻性研究進一步驗證。腫瘤的發(fā)生是一個復雜的過程，DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生關系明確，但仍有諸多問題需要進一步研究，以便更好地了解DNA甲基化調(diào)控過程，從而為宮頸癌的早期診斷和治療提供新思路。