夏枯草水提液對自身免疫性甲狀腺炎大鼠5-HT和Th17的影響

張紅 ，耿輝 ，曲海麗 ，鐘霞

（1．山東第一醫(yī)科大學附屬山東省立醫(yī)院全科醫(yī)學科，濟南 250021；2．山東第一醫(yī)科大學附屬山東省立醫(yī)院藥學部，濟南 250021；3．山東第一醫(yī)科大學附屬山東省立醫(yī)院護理部，濟南 250021）

自身免疫性甲狀腺炎（AIT）是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，CD4+T細胞異?；罨前l(fā)病的重要原因[1]。臨床中以橋本甲狀腺炎多見，以甲狀腺內(nèi)淋巴細胞（尤其是T淋巴細胞）浸潤、抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）和抗甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）升高為主要特點[2]，是碘充足地區(qū)獲得性甲減最常見的病因[3]。近幾十年來全球范圍內(nèi)AIT的發(fā)病率顯著提高[4]，中國AIT的患病率為1.6%，發(fā)病率為6.9/1 000[5]。遺傳和環(huán)境因素共同導致的免疫失調(diào)和甲狀腺自身免疫抗體對甲狀腺本身的攻擊是AIT發(fā)生的主要原因[6]，目前沒有針對病因的治療方法。

5-羥色胺（5-HT）又名血清素，作為一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)被人們熟知，是調(diào)節(jié)神經(jīng)活動的重要物質(zhì)，大量研究表明：中樞5-HT減少可產(chǎn)生情緒低落等抑郁情緒甚至抑郁癥[7-9]。近幾年來越來越多的研究表明，5-HT在免疫過程中發(fā)揮重要作用[10]，5-HT信號系統(tǒng)可能是免疫炎癥介質(zhì)的一個重要靶點[11]。外周的5-HT可通過作用于表達5-HT受體（5-HTRs）的免疫細胞發(fā)揮作用，T淋巴細胞可表達5-HT多種受體，如5-HT2AR，5-HT1B等[12]。因此，推測5-HT可能通過作用于T淋巴細胞參與了AIT的發(fā)病，糾正異常的5-HT可以恢復免疫穩(wěn)態(tài)。

夏枯草性寒、味苦、入肝經(jīng)，是治療甲狀腺疾病的最主要中藥材之一[13]。夏枯草廣泛應用于橋本甲狀腺炎的治療，鄭慧娟等[14]篩選了治療橋本甲狀腺炎的中醫(yī)藥方劑232條共212味中藥材，其中使用夏枯草的方劑有128條，用藥頻次在橋本甲狀腺炎相關(guān)方劑中居于前列。本研究中，進一步研究夏枯草通過調(diào)節(jié)色氨酸代謝相關(guān)指標5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（SERT），5-HT和Th17治療自身免疫性甲狀腺炎大鼠（EAT）的機制。

1 材料

1.1 藥材提取 夏枯草采自貴州省畢節(jié)市納雍縣，采集時間：2018年7月。標本存放于貴州省貴陽市新天藥業(yè)股份有限公司中藥實驗室，標本號：2017112。

夏枯草水提液由貴州省貴陽市新天藥業(yè)股份有限公司提取。提取方法：新鮮的夏枯草果穗在38℃的風干機中恒濕風干10 d，然后用40目篩子研磨；70℃條件下加適量蒸餾水回流提取2 h，提取液經(jīng)濾紙組合過濾3次；濾液濃縮并冷凍干燥，最后將干燥的提取物溶于1 L生理鹽水中。水提物經(jīng)過過濾滅菌，并在實驗使用之前用凝膠法測定內(nèi)毒素水平。

1.2 UPLC-ESI-MS/MS法 在LCMS-8050系列質(zhì)譜儀上用UPLC-ESI-MS鑒定水提物的化學成分。采用Waters ACQUITY HSST3色譜柱（100mm×2.1mm I.D.；1.8 μmol/L particle size；Waters，USA），流動相為0.5%甲酸雙蒸水（溶劑A）和乙腈（溶劑B）。梯度洗脫條件為：流速0.4 mL/min，5%～10%溶劑A梯度洗脫5 min，10%～35%溶劑A梯度洗脫5～8 min，35%～65%溶劑A梯度洗脫8～20 min。以氮氣為霧化氣體，流速為3.0 L/min，干氣為1 L/min。碰撞氣體為氬氣，碰撞電壓為35 V，400℃溫度段內(nèi)熱氣流速為10 L/min。界面溫度為300℃，DL溫度為250℃。

1.3 高效液相色譜法（HPLC） 迷迭香酸標準品來自中國食品藥品生物制品研究所（批號100963538，Sigma-Aldrich，USA；純度：99%）。采用體積排阻色譜柱（Agilent5TC-C18，USA，Agilent），在 Daojin LC-20CE高效液相色譜系統(tǒng)上分析夏枯草提取物的含量。色譜柱為Elite Hypersil 18柱（5 pm，250 nm×4.6 nm），流動相為甲醇-0.1%甲酸（18∶82，0～20 min）和甲醇-0.1%甲酸（32∶68，20～60min），流速 1.0mL/min，柱溫30°C，檢測波長330 nm，迷迭香酸≥5 000理論板數(shù)。

1.4 動物造模和藥物干預 造模和干預方法見圖1。雌性 Lewis大鼠（LEW/Crl-113），6～8周齡，購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于山東省立醫(yī)院SPF級動物實驗中心，環(huán)境溫度（24±2）℃，自由飲水，光照：黑暗=1∶1。適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為EAT組和對照組（CON）。EAT模型造模方法如前所述[15]。簡言之，將Tg粉末溶解于濃度為0.2 mg/mL的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，并與等體積的完全弗氏佐劑（CFA）混合。自第2周至第8周，EAT組大鼠每日飲用0.05%碘化鈉溶液，CON組大鼠飲用無菌蒸餾水；同時，在第2周和第6周，采用多點（頸部、雙側(cè)腹股溝、足墊）皮下注射方法對EAT組大鼠注射配置好的Tg/CFA溶液（200 μL/只）。第8周開始，將EAT組大鼠隨機分為模型對照組（EAT），夏枯草低劑量組（E-LOW），夏枯草中劑量組（E-MID），夏枯草高劑量組（E-HIG），每日通過灌胃分別給藥2 mL/kg PBS，1 mL/kg夏枯草提取液，2 mL/kg夏枯草提取液，4 mL/kg夏枯草提取液。連續(xù)灌胃12周后，麻醉后經(jīng)鎖骨下靜脈采集全血，一部分離心分離血清，一部分使用外周血單個核細胞（PBMCs）分離液提取外周血PBMCs；通過頸正中切口輕輕分離兩葉甲狀腺。

圖1 動物造模和藥物干預示意圖

1.5 甲狀腺體積超聲測定 將大鼠上門齒和四肢固定在木板上，使用脫毛膏清除頸部毛發(fā)，由兩名經(jīng)驗豐富的B超醫(yī)生測量大鼠甲狀腺的長徑（a）、寬徑（b）及厚徑（c），甲狀腺體積計算公式為：按公式 V=π/6×a×b×c，左、右葉及峽部相加為甲狀腺總體積。

1.6 甲狀腺H&E染色 取出甲狀腺后迅速用4%多聚甲醛固定，組織脫水條件：70%乙醇過夜，80%乙醇 30 min，90%乙醇 30 min，95 乙醇 20 min，95%乙醇20 min，100%乙醇20 min，二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ30 min，二甲苯Ⅲ30 min，石蠟Ⅰ1 h，石蠟Ⅱ1 h，石蠟Ⅲ1 h。

常規(guī)方法包埋、切片，切片厚度3～4 μm，56℃烤片2 h。H&E染色條件：二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ8 min，二甲苯Ⅲ8 min，無水乙醇5 min，90%乙醇3 min，80%乙醇3 min，70%乙醇2 min，自來水沖洗5 min，蘇木素3 min，自來水沖洗至水清，1%鹽酸乙醇分化3s，自來水沖洗1 min，1%伊紅浸染5 min，自來水沖洗1 min，80%乙醇1 min，95%乙醇1 min，無水乙醇Ⅰ2 min，無水乙醇Ⅱ2 min，中性樹膠封片，晾干，光鏡下觀察甲狀腺的病理變化。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） 血清樣品制備：使用2 mL一次性注射器穿刺大鼠鎖骨下靜脈取1.5～2 mL靜脈血，1 000×g離心 15 min，分離血清至微型離心（EP）管中，血清短期保存于-20℃冰箱，長期保存于-80℃冰箱。

脾組織樣品制備：脾臟取出后剪取一小部分，用預冷的PBS沖洗后，脾組織中加入適量生理鹽水使用無菌注射器搗碎，1 000×g離心10 min，取上清液。

ELISA測定：根據(jù)不同測定指標的試劑盒說明書進行相應的操作。

1.8 流式細胞術(shù)測外周血Th17淋巴細胞亞群 外周血PBMCs懸液與胞內(nèi)因子刺激劑共培養(yǎng)：將刺激劑在37℃的水浴鍋中完全融化，每毫升細胞懸液中加入2 μL胞內(nèi)因子刺激劑，放入37℃5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h；收集細胞后，離心，棄上清；加入2.5 mL PBS重懸，離心，棄上清；再次加入2.5 mL PBS重懸，離心，棄上清；用100 μL PBS重懸細胞，準備標記抗體。

抗體標記：使用移液器向細胞懸液中加入1 μL CD4-PE/CY7抗體，冰上避光孵育25 min；加入2 mL PBS重懸細胞，離心，棄上清；重復上一步；加入100μL PBS；向管底加入100 μL細胞固定液，震蕩，離心，避光孵育20～60 min；加入2 mL 1×破膜液，重懸細胞，以400×g離心5 min，棄上清；再次加入1×破膜液，重懸，離心，棄上清；然后進行胞內(nèi)染色，管內(nèi)留約100 μL的破膜液，加入IL-17A-FITC，室溫避光孵育60 min；管中加入2 mL 1×破膜液洗滌兩次后，棄上清，加入 150 μL 1×PBS PBS 重懸，加入 150 μL的4%多聚甲醛；用封口膜密封管口，放入4℃冰箱中避光冷藏。

上機檢測：使用LSR Fortessa檢測，調(diào)電壓調(diào)補償后，通過 FlowJo軟件（Tree Star Inc.，Ashland，OR，USA）進行數(shù)據(jù)分析。

1.9 qRT-PCR檢測脾臟和小腸中的SERT水平 大鼠脾臟和小腸組織取材后迅速放入Triol中并在-80℃中保存，組織總RNA提取按照試劑盒說明操作，用紫外分光光度計測量OD值并計算RNA濃度；根據(jù)RNA的量，建立1個20 μL的反應體系，在RT-PCR儀器中進行逆轉(zhuǎn)錄反應：37℃15 min，85℃5 s，4℃冷卻，-20℃保存；在PCR儀上擴增：PCR反應條件：

引物由 BioSune Biotechnology Co.，Ltd.公司合成；目的基因擴增用ΔΔCT法計算，A=CT（目的基因，實驗樣本）-CT（內(nèi)標基因，實驗樣本），B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內(nèi)標基因，對照樣本），K=A-B，表達倍數(shù)=2-K，采用β-actin為內(nèi)參，計算TPH1、SERT的CT值。SERT引物序列見表1。

表1 SERT引物序列

1.10 統(tǒng)計分析 采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的定量變量報告用均值±標準差（±s）進行表示。采用單因素方差分析進行組間統(tǒng)計比較，采用配對t檢驗進行兩組間差異的統(tǒng)計比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 迷迭香酸是夏枯草的主要活性成分 UPLCESI-MS/MS色譜圖如下，見圖2。通過匹配每個色譜峰的分子量，共得到10個組分，見表2。迷迭香酸（Rosmarinic Acid）是夏枯草提取物的主要成分。

圖2 夏枯草提取物的UPLC-ESI-MS/MS色譜圖

表2 夏枯草提取物的化學成分分析

2.2 夏枯草水提液可降低EAT大鼠甲狀腺體積和血清自身免疫抗體水平 在夏枯草治療前（第8周），通過檢測大鼠B超體積和血清TgAb水平，確定大鼠造模成功，結(jié)果表明，如表3所示，相比于CON組，EAT造模的大鼠血清TgAb水平均顯著升高（P<0.01），甲狀腺 B超體積均顯著增大（P<0.01），結(jié)果提示EAT模型構(gòu)建成功；經(jīng)過夏枯草治療12周后，再次檢測大鼠血清TgAb和B超體積，并比較治療前后的差異（見表3）和低中高劑量組治療前后甲狀腺體積和TgAb減少的差值（見表4）。結(jié)果表明，夏枯草各劑量治療后TgAb均下降（P<0.05或P<0.01），低、中劑量組的前后差值相比沒有統(tǒng)計意義，夏枯草高劑量組灌胃后降低TgAb的效果相最明顯（2.064±0.305 4 IU/mL），差值明顯高于中劑量組（P<0.05）和低劑量組（P<0.01）；夏枯草各劑量治療后甲狀腺體積均減小（P<0.01），低、中、高劑量組大鼠灌胃后甲狀腺體積較前分別減少3.742±0.503 4 mm3，6.725± 0.417 8 mm3和 8.133± 0.480 0 mm3，分別下降11%，19.5%和23.6%，提示夏枯草口服液可呈劑量依賴性減少甲狀腺的體積。

表3 夏枯草治療前后大鼠的血清TgAb和甲狀腺體積

表4 夏枯草治療前后大鼠的血清TgAb和甲狀腺體積減少的差值

2.3 夏枯草水提液減輕甲狀腺炎癥 在夏枯草治療結(jié)束后，通過H&E切片觀察各組大鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)，如圖3所示，CON組大鼠的甲狀腺濾泡形態(tài)規(guī)則，濾泡間無炎性細胞浸潤；EAT組大鼠的甲狀腺濾泡被大量破壞，濾泡間可見大量的淋巴細胞浸潤，說明EAT模型造模成功。E-LOW組大鼠甲狀腺濾泡間隙可見大量淋巴細胞浸潤，相比于EAT組治療作用不明顯；E-MID和E-HIG組中甲狀腺內(nèi)淋巴細胞浸潤面積明顯縮小，說明中高劑量的夏枯草具有減輕甲狀腺炎癥的作用。

圖3 各組大鼠甲狀腺組織形態(tài)和HE染色（×100）

2.4 夏枯草水提液可以抑制EAT大鼠PBMCs中升高的Th17淋巴細胞亞群及相關(guān)細胞因子 為了研究夏枯草水提物治療EAT的機制，我們通過流式細胞術(shù)檢測了各組大鼠PBMCs中Th17細胞的表達，結(jié)果表明，相比于CON組，EAT組大鼠的Th17細胞比例顯著增加（P<0.01），經(jīng)過治療后夏枯草低中高劑量組PBMCs的Th17細胞比例顯著增加（P<0.01，見圖4）；通過ELISA方法檢測大鼠血清中Th17細胞相關(guān)細胞因子IL-17A和IL-6，如圖5所示，相比與CON大鼠，EAT大鼠血清中的IL-17A和 IL-6均升高（P＜0.01），經(jīng)過夏枯草治療后，EAT大鼠血清中IL-17A顯著下降（P＜0.01），IL-6雖有下降趨勢，但是沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.01）。

圖4 夏枯草水提液降低大鼠PBMCs中Th-17淋巴細胞的水平

圖5 夏枯草水提液對EAT大鼠血清IL-17A（A）和IL6（B）的影響

2.5 夏枯草水提液可以抑制大鼠脾臟中SERT水平 評估脾臟中SERT的表達。結(jié)果表明，相比于CON組，EAT組脾臟中的SERT顯著增加，中高劑量組大鼠可以降低大鼠脾臟中SERT含量（P＜0.01）。

圖6 夏枯草水提液降低大鼠脾臟中SERT mRNA水平

2.6 夏枯草水提液可上調(diào)脾臟和血清中的5-HT水平 與CON組大鼠相比，EAT大鼠脾臟和血清中5-HT下降（P＜0.01），經(jīng)過夏枯草水提液治療12周后，低劑量大鼠脾臟和血清中5-HT無顯著變化（P＞0.01），中高劑量組大鼠脾臟和血清中5-HT顯著升高（P＜0.01，見圖 7）。

圖7 夏枯草水提液提高大鼠脾臟（A）和血清（B）中5-HT水平

3 討論

本實驗中，通過高碘水結(jié)合Tg免疫的方法建立了EAT模型，該造模方法已經(jīng)廣泛應用于AIT的動物實驗研究[16-17]。經(jīng)過夏枯草水提液治療后，結(jié)果表明夏枯草可以有效降低EAT大鼠血清中TgAb和甲狀腺體積，減輕甲狀腺內(nèi)炎癥浸潤，降低血清中過表達的Th17淋巴細胞比例，結(jié)果還表明，脾臟中5-HT水平增加可能是抑制Th17的機制。

夏枯草在人體和動物實驗中已被證實具有治療AIT的作用，夏枯草口服液可以顯著降低橋本甲狀腺炎患者中TgAb和TPOAb水平[18]，夏枯草水提液可有效減輕EAT大鼠甲狀腺內(nèi)的炎性浸潤，降低自身免疫抗體，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡[19]。本研究中，結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致[20]，夏枯草水提液減輕了EAT大鼠中的炎性細胞浸潤，降低了血清中自身免疫抗體，減小了甲狀腺體積，證實該藥物對EAT具有確切的治療作用。盡管目前關(guān)于夏枯草治療AIT的研究較多，但是具體的治療機制尚不明確，為進一步研究夏枯草治療EAT的機制，我們進行了更深入的研究。

本實驗中，首先檢測了大鼠PBMCs中CD4+IL-17+Th17淋巴細胞的比例，EAT大鼠Th17淋巴細胞相比于CON大鼠比例顯著升高，夏枯草治療后的大鼠Th17淋巴細胞比例顯著下降，結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，即橋本甲狀腺炎患者外周血中Th17比例顯著高于正常人，服用夏枯草膠囊后可以降低Th17比例[21]，結(jié)果表明夏枯草水提液具有調(diào)節(jié)T淋巴細胞從而調(diào)節(jié)免疫的作用。

5-HT通過受體5-HT2AR作用于T淋巴細胞參與免疫反應，推測夏枯草水提液可能通過調(diào)控5-HT的表達和活性發(fā)揮調(diào)節(jié)Th17的作用，與預期一致，本實驗結(jié)果表明，EAT模型大鼠中，脾臟中和外周血清中的5-HT下降；夏枯草治療后中高劑量組的血清中5-HT升高，變化趨勢與Th17一致。該結(jié)果與一項關(guān)于類風濕性關(guān)節(jié)炎的研究結(jié)果一致[22]，Yasmine將分別將WT和Tph1-/-（Tph1為合成5-HT的限速酶）類風濕性關(guān)節(jié)炎小鼠的脾臟制成單細胞懸液，并分別用或者不用不等濃度的5-HT進行體外培養(yǎng)，72 h后通過ELISA法檢測上清液中IL-17A含量，結(jié)果表明，相比于WT小鼠脾細胞上清中IL-17A含量，Tph1-/-小鼠脾細胞上清中IL-17A明顯升高（P<0.05），Tph1-/-小鼠脾細胞與不同濃度5-HT共培養(yǎng)后的IL-17A水平顯著下降（P<0.05），接近WT小鼠脾細胞的IL-17A水平，作者認為補充5-HT可以降低過度表達的Th17。另外，SERT具有轉(zhuǎn)運攝取5-HT的功能，本實驗中，還通過PCR驗證了脾臟中SERT的含量，結(jié)果表明，EAT模型組脾臟中SERT升高，該結(jié)果與Cai等[23]在AIT小鼠模型中的研究結(jié)果一致，AIT小鼠的大腦額葉皮質(zhì)SERT上升，5-HT下降。本研究中，經(jīng)過夏枯草治療后脾臟中SERT下降，說明夏枯草提取物具有降低SERT減少5-HT再攝取，從而提高體內(nèi)5-HT水平的功效。

本實驗中，還檢測了Th17的相關(guān)細胞因子IL-17A和IL-6，與預期一致的是，IL-17A在治療前后的變化與Th17一致，即在EAT模型中升高，夏枯草水提液治療后下降，值得注意的是，IL-6在EAT模型中升高，該結(jié)果與Sun等[24]在自身免疫性甲狀腺炎NOD.H-2h4小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的血清IL-6的變化趨勢一致，但是治療后的IL-6雖有下降的趨勢卻沒有統(tǒng)計學意義，探究其原因可能為：IL-17A和IL-6都可以誘導Th17分化，IL-6雖然在夏枯草治療后有下降趨勢，但是沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），本研究結(jié)果認為IL-6下降可能不是引起Th17下降的主要原因，夏枯草主要通過降低IL-17A發(fā)揮降低Th17的作用。

根據(jù)文獻報道，IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子可直接誘導中樞或者外周系統(tǒng)中SERT的表達[25-29]，而夏枯草已經(jīng)被證實可有效降低EAT血清IL-17A、IL-6等細胞因子水平[30-31]。因此，推測夏枯草提取物入血后可能是通過降低促炎細胞因子誘導了SERT的水平的下降。SERT可以回收5-HT，促進5-HT被細胞內(nèi)的單胺氧化酶降解，在免疫系統(tǒng)中，樹突狀細胞通過表達SERT，將5-HT儲存到囊泡中并調(diào)節(jié)T淋巴細胞的行為[32-33]，T淋巴細胞是EAT發(fā)病機制中的主要細胞。夏枯草導致SERT水平降低，減少了對5-HT的再攝入，從而提高脾臟和PBMCs中的5-HT含量，進一步調(diào)控體內(nèi)表達5-HT受體（5-HTRs）的免疫細胞。體內(nèi)增多的5-HT被脾臟淋巴結(jié)組織樹突狀細胞捕獲，呈遞抗原給T細胞，抑制Th17細胞分化，同時可能通過血液遷移到甲狀腺組織發(fā)揮作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[23]。

橋本甲狀腺炎在歸屬于中醫(yī)“癭病”范疇，氣滯、痰濁、血瘀壅結(jié)于頸前是發(fā)病的重要病機，《諸病源候論》認為該病“由憂恚氣結(jié)所生”，現(xiàn)代研究也認為，情緒壓力導致代謝紊亂或者免疫失調(diào)進而參與EAT發(fā)病，因此EAT發(fā)病與情志變化密切相關(guān)[34]。5-HT在中樞系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)情緒的作用，在外周具有調(diào)節(jié)免疫的作用，因此，5-HT可能是治療EAT的一個新的切入點，深入研究通過調(diào)控5-HT治療EAT具有重要的臨床意義。