淫羊藿苷治療骨質疏松的相關通路研究進展

張浩，鄭玉玲，丁輝

（天津中醫藥大學中一制藥有限公司，天津 301617）

骨質疏松在中國有著較高的發病率，特別是50歲以上的中老年人，且女性的發病率遠遠高于男性，這是因為女性在絕經之后雌激素缺乏而導致的，骨質疏松已經成為威脅中老年人生活質量的常見病和多發病。目前治療骨質疏松的藥物主要分為兩類：抗吸收藥物和合成代謝劑，抗吸收藥物有雙磷酸鹽（股骨骨折和頜骨壞死）、狄諾塞麥（皮膚濕疹和蜂窩組織炎）、選擇性雌激素受體調節劑（血栓栓塞和中風）、降鈣素（背痛和頭痛），新出現的有組織蛋白酶K抑制劑、拉索昔芬等；合成代謝劑包括甲狀旁腺素（骨肉瘤等）、雷尼酸鍶（心臟問題），新出現的有抗硬化素抗體、多奈哌齊以及抑制骨髓脂肪生成的療法等。中醫學認為腎主骨生髓，腎對骨的生長、發育、平衡起著非常重要的作用，淫羊藿作為補腎藥，藥用歷史悠久，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效，主要用于陽痿遺精、腎陽虛衰、風濕痹痛、筋骨萎軟、麻木拘攣等證[1]。淫羊藿苷是其中主要活性單體，現代醫學實驗表明：淫羊藿苷對骨組織、生殖系統、心血管系統、免疫系統、腫瘤、炎癥等均有作用[2]。主要有3種細胞參與骨的生長與重建，包括軟骨細胞、成骨細胞和破骨細胞，其中成骨細胞可以促進骨形成，破骨細胞可以促進骨吸收，當骨吸收大于骨形成時，就會造成骨量減少，進而導致骨質疏松，淫羊藿苷可以通過多種信號通路活化成骨細胞、抑制破骨細胞，來對骨質疏松產生治療作用，本文主要對淫羊藿苷抗骨質疏松作用的信號通路作出綜述，以期為淫羊藿苷的進一步開發提供思路。

1 Wnt/β-catenin 通路

Wnt通路是由配體糖蛋白Wnt與LRP5/6和卷曲蛋白（FZD）組成的受體復合物的結合而激發的一種信號傳導途徑[3]，包括經典的Wnt/β-catenin通路和兩條非經典通路，Wnt/Ca2+-dependent通路和Wnt/planar cell polarity（PCP）通路。Wnt通路與乳腺癌[4]、胃癌[5]、卵巢癌[6]、阿爾茲海默癥[7]等疾病關系密切，其中經典的Wnt/β-catenin通路對骨質積聚、骨重塑和骨折修復至關重要[8]。Wnt/β-catenin通路在BMSCS的成脂成骨分化過程中發揮重要的作用，如李智奎等[9]使用不同濃度的淫羊藿苷體外培養骨質疏松大鼠BMSCS，探討淫羊藿苷對BMSCS成骨與成脂雙向分化的作用與機制，通過實驗證明淫羊藿苷通過Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠BMSCS成骨分化，抑制其成脂分化作用；淫羊藿苷也可以上調Wnt通路的上下游基因來調節骨平衡，如Wang等[10]發現淫羊藿苷能夠上調Runx2、cyclinD1和ALP的mRNA表達水平，通過Wnt/β-catenin通路促進成骨細胞增殖，其他通路可能參與了這一過程，但是淫羊藿苷的作用濃度還有待進一步研究；Huang等[11]對比了有無淫羊藿苷培養的間充質干細胞，并對其進行了RT-PCR和Western blot檢測，結果表明淫羊藿苷能夠上調成骨基因Runx2、OCN、OSX的表達，并且可以通過上調P-GSK來抑制βcatenin的降解。

2 OPG/RANK/RANKL通路

RANK（NF-kB 受體活化因子，TNFRSF11A）是位于破骨細胞上的RANKL（NF-kB受體活化因子配體，TNFSF11）的受體，RANKL與RANK結合后會激活破骨細胞，使其增殖分化，而OPG（骨保護素，TNFRSF11B）可以特異性的與RANKL競爭RANK，抑制破骨細胞的增殖，最近研究發現，OPG/RANK/RANKL通路對牙齒萌發[12]、神經系統等有作用[13]，運動訓練可以通過增加OPG，降低RANKL來促進骨骼健康[14]，OPG/RANK/RANKL還與血管系統、免疫系統和骨關節有關[15-16]。

淫羊藿苷可以增加OPG/RANKL的比例，如吳祖峰等[17]探究不同劑量淫羊藿苷對骨質疏松大鼠OPG、RANK、RANKL表達的影響，發現治療組OPG mRNA表達增加，RANKL mRNA、RANK mRNA表達下降，結果表明不同劑量淫羊藿苷可使骨質疏松癥模型大鼠脛骨干骺端組織中OPG mRNA的表達升高，RANKL mRNA，RANK mRNA的表達降低，從而達到治療骨質疏松癥的目的；Qi等[18]通過給大鼠注射鏈脲佐菌素來構建糖尿病型骨質疏松，發現100 mg/kg的淫羊藿苷可以降低血糖、增加骨密度、降低血清骨轉換標記物水平、增加Runx2、OPG/RANKL比例，這些結果表明淫羊藿苷通過上調Runx2和OPG/RANKL的比例來治療糖尿病型骨質疏松癥；Wang等[19]發現淫羊藿苷與力負荷刺激耦合作用去卵巢小鼠，發現與淫羊藿苷或力負荷刺激單獨使用相比，可以顯著提高OPG/RANKL的比例，這表明力負荷刺激聯合淫羊藿苷可能比單獨使用力負荷刺激治療骨質疏松具有治療優勢。OPG/RANK/RANKL通路主要調節破骨細胞的增殖與活化，對破骨細胞的存活有重要意義。

3 MAPK通路

MAPK作為細胞內重要的信號傳遞者，從酵母菌到人類，所有真核生物都能在體內表達MAPK，它調解著細胞增殖、分化到凋亡的多個過程，它可以磷酸化很多的蛋白質，并極大地影響基因表達、代謝、細胞分裂等過程。MAPK包括三層激酶級聯反應-MAPK3K、MAPK2K、MAPK，在哺乳動物中，MAPK主要有三個家族，分別是ERKS、JNKS、P38/SARKS，已經確定的 MAPKS 家族有：ERK1、ERK2、ERK3/ERK4、ERK5；JNK1、JNK2、JNK3；P38α、P38β、P38γ、P38δ[20-21]。研究發現，淫羊藿苷可以通過抑制p38、JNK、ERK等調節BMSCS的分化，抑制破骨細胞來調節骨平衡。

Liu等[22]在OGD條件下研究淫羊藿苷對兔BMSCS的作用，發現淫羊藿苷通過對p-ERKS、p-P38、p-JNK的抑制來抵抗細胞自噬，進一步說明淫羊藿苷是通過MAPK途徑來保護兔BMSCS的；Xu等[23]研究了淫羊藿苷對RANKL誘導的破骨細胞的影響，其結果表明淫羊藿苷對BMMS和RAW264.7細胞系的RANKL誘導的破骨細胞具有抑制作用，并且其作用有可能是通過對NF-kB和MAPK的活性來抑制的；陳喆[24]為了探究淫羊藿苷在單核細胞向破骨細胞分化的過程中對MAPK信號通路的影響，利用淫羊藿苷對RAW264.7細胞進行培養，發現淫羊藿苷對單核細胞的破骨分化具有穩定的抑制作用，且可以顯著抑制p38、ERK、JNK的磷酸化水平。

4 Notch通路

Notch作為一種跨膜受體，同時也是一種轉錄因子，控制著細胞的生長以及分化，影響著胚胎形成、發育以及體內平衡，在哺乳動物中，有4種Notch基因和5種基因編碼配體——3種Delta-like和2種jagged[25-26]。Notch的另一個特點是它依賴信號傳遞和信號接收細胞的內吞作用，這種內吞作用有著幾種加工模式，來抑制或者激活Notch通路[27]。Notch是少數幾條在多細胞生物的胚胎和成人發育過程中反復使用的信號通路之一[28]，它對T細胞的發育和功能起著至關重要的作用，與各種遺傳疾病和癌癥有關[25]，并且，Notch和骨質疏松的關系也非常密切[29]。Notch通路的機制是NECD（Notch extracellular domain）的 ECF（epidermal growth factor）重復序列與其配體（Delta-like，jagged）結合，然后ADAM/TACE（transmembrane proteases family）會 切割結合時暴露的金屬蛋白酶位點，產生NECT（Notch extracellular truncation），NEXT 作為 γ-分泌酶的底物，與γ-分泌酶作用后裂解產生NICD（Notch intracellular domain），之后NICD進入細胞核與CBF1或RBPJ結合，在 MAML（Mastermind-like）和 p300 的作用下開始目標基因的表達，淫羊藿苷可以通過調節Notch通路組成成分jagged、CBF1等影響MSCS的分化。

徐婭等[30]為了觀察淫羊藿苷對離體培養大鼠BMSCS的增殖、骨向分化能力，利用pNPP和ELISA手段檢測ALP和BGP，應用Western Blotting方法檢測Notch1和CBF1蛋白表達水平，結果顯示各組的ALP、BGP顯著提高，CBF1表達水平下降，表明ICA能夠促進MSCs骨向分化，能通過下調Notch信號核心結合蛋白CBFl的表達抑制Notch信號通路；Xu等[31]報道淫羊藿苷可以顯著提高成骨標記物的基因表達并增加MC3T3-E1和C3H10T1/2細胞的ALP活性，卵巢切除小鼠的Notch通路分子的mRNA水平升高，而在淫羊藿苷治療之后表達水平顯著降低，這些表明ICA通過抑制Notch信號傳導途徑，在體外促進成骨分化并在體內減輕骨質疏松癥；Liu等[32]為了研究淫羊藿苷抗骨質疏松的機制，使用定量聚合酶聯反應、蛋白質印跡等方法來觀察對去卵巢大鼠Notch通路的影響，發現淫羊藿苷會下調骨組織中Notch1細胞內結構域和jagged1蛋白的表達，會減低Notch1細胞內結構域對Notch2mRNA表達的影響，以上結果說明ICA通過Notch信號通路來抑制間充質干細胞向脂肪細胞的分化。

5 Hedgehog通路

Hedgehog是以果蠅突變表皮的多刺外觀而命名的，它在脊椎動物和無脊椎動物的發育過程中起著非常重要的作用[33]。Hedgeho（HH）由HH蛋白：Sonic HH （SHH）、Indian HH （IHH）、Desert HH（DHH）；修補受體（Patched receptor）；平滑受體（Smoothened receptor）；融合同源物的抑制劑（Suppressor of fused homolog）；驅動蛋白（kinesin protein）Kif7；蛋白激酶 A（PKA）和 GLI轉錄因子組成[34]，其中SHH對細胞的增殖、分化和正常發育起著關鍵的作用，與各種癌癥有關；DHH僅作用于性腺，包括精子、卵巢顆粒細胞和睪丸支持細胞等；而IHH與血管生成及骨骼形成有關[35-37]。

淫羊藿苷主要通過調節IHH來促進成骨細胞和軟骨細胞的分化，如Luo等[38]使用小鼠前交叉韌帶橫切術模型和小鼠軟骨細胞來確定淫羊藿苷對骨關節炎的作用，發現淫羊藿苷可以顯著減少軟骨的變性，增加軟骨的厚度，并且可以下調IHH和受IHH調控的基因，從而促進軟骨細胞分化，這些說明淫羊藿苷可以減少骨關節炎小鼠模型的軟骨破壞，促進軟骨細胞分化；除了對IHH的調節外，淫羊藿苷也可以調控SHH的表達，如辛紅美等[39]為了研究淫羊藿苷對MC3T3-E1前成骨細胞系增殖和分化的影響，利用CCK-8檢測MC3T3-E1細胞增殖活性；使用茜素紅染色方法（AR-S）檢測成骨分化和鈣結節的形成；應用Western blot方法檢測osteocalcin、ALP、Shh蛋白表達，并測定ALP活性，結果顯示淫羊藿苷可以顯著促進MC3T3-E1細胞增殖，使ALP活性和蛋白表達量明顯升高，綜上可以判斷ICA能夠通過Hedgehog信號通路促進成骨細胞增殖和分化。

6 BMP/Smads通路

BMP是TGF-β超家族的一種組成成分，存在于細胞外基質中，通過與存在于細胞表面的受體結合來執行不同的功能。而Smad是BMP受體下游的轉錄調節因子，共有3種類型——R-Smads、Co-Smads、I-Smads，當BMP與其受體（BMP2等）結合之后，Smad1/5/8被激活，與Smad4作用形成二聚體，轉移到細胞核，與Runx2等轉錄因子結合來調控基因轉錄，進而促進成骨細胞分化[40-41]。

淫羊藿苷可能通過信號級聯BMPS/BMP2-Smad1/5/8-Runx2/Osterix來調控細胞的增殖與分化，訾慧等[42]發現淫羊藿素可能通過激活BMP/Runx2/Osx信號通路，上調Runx2、Osterix的轉錄表達，來促進大鼠BMSCS分化為成骨細胞；安慶等[43]利用淫羊藿苷培養MC3T3-E1細胞，發現淫羊藿苷促進成骨細胞的增殖與分化可能是通過激活BMP-2/Smads信號通路，上調Smad1/5/8等蛋白的表達來實現的；李雪等[44]通過在原代分離培養人牙周膜細胞中加入淫羊藿苷，發現淫羊藿苷可以上調Runx2、BMP2的基因和蛋白表達；笪巍偉等[45]通過淫羊藿苷干預前成骨細胞株OCT-1細胞，發現淫羊藿苷通過激活前成骨細胞中BMP信號通路，上調Runx2的表達，來誘導成骨細胞的增殖和分化。

7 PI3K/Akt通路

PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）位于細胞內，與癌基因的產物相關，有兩個亞單位：P85、P110。Akt作為PI3K下游靶標，具有進化保守性，有著3種類型——Akt1、Akt2、Akt3，Akt1 在腦、心臟、肺中表達，Akt2在骨骼肌中表達，Akt3在腦、腎、胚胎心臟中表達，PI3K/Akt通路的激活機制是活化的RTK（酪氨酸激酶）將P85α-P110α異二聚體募集到細胞膜上，底物PIP2（磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸）被轉化成 PIP3（磷脂酰肌醇三磷酸），PIP3會與Akt結合，使其轉移到細胞膜上，在PDK1和PDK2的輔助下被激活，之后Akt會激活或失活下游因子，如NF-kB、AP-1、GSK3、Bad、FOXO、mTORh 和 HIF-1[46-48]。PI3K/Akt通路控制著細胞生長、增殖與凋亡，與腫瘤、血液疾病、神經系統等有關，近年來的一些藥理實驗表明，PI3K/Akt通路與骨的關系也非常密切[49-50]。

淫羊藿苷通過PI3K/AKT通路及其下游轉錄因子eNOS、mTOR等來調節BMSCS，如郭曉宇等[51]采用貼壁分離法培養BMSCS，采用PI3K阻斷劑LY294002 和 Western blot法對 p-AKT、eNOS、iNOS進行蛋白定量分析，結果表明淫羊藿苷通過PI3K/AKT-eNOS途徑促進BMSCs的成骨性分化；唐望[52]等利用兔的股骨骨髓來培養BMSCS，采用Transwell小室跨膜實驗來觀察Akt通路抑制劑LY294002對淫羊藿苷的影響，應用Western blotting方法來檢測淫羊藿苷對PI3K及Akt蛋白的表達影響，其結果表明淫羊藿苷在體內外通過上調PI3K/Akt信號通路促進骨髓間充質干細胞遷移；Yao Xudong等[53]發現淫羊藿苷可能通過PI3K/Akt/mTOR以及ERK1/2和JNK途徑來預防鐵過載引起BMSCS功能障礙。

8 PPAR-γ通路

PPAR-γ屬于PPARs（過氧化物酶體增殖物激活受體）超家族的一員，是一種核激素受體和配體激活的轉錄因子，由A/B（配體非依賴性激活結構域）、C（DNA 結合結構域）、D（鉸鏈結構域）和 E/F（配體結合結構域-LBD）等組成[54]，而PPAR超家族除了PPAR-γ，還有另外兩個亞型——PPAR-α、PPAR-β/δ。PPAR-α主要在心臟、肝臟和骨骼肌中表達[55]；PPAR-β/δ 研究較少，主要在脂肪組織中表達，促進脂肪氧化；PPAR-γ主要在皮脂細胞和脂肪組織中表達，會控制脂肪細胞分化，抑制成骨細胞的表達，與糖尿病、心血管疾病、皮膚病關系密切[56]，而最新研究發現PPAR-γ可能是一個治療新冠病毒的潛在靶點[57]。

淫羊藿苷通過PPAR-γ通路促進骨髓間充質干細胞的成骨分化，抑制其成脂分化來治療骨病，如謝小偉等[58]通過體外研究發現淫羊藿苷可以抑制Wnt通路，促進BMSCS的成骨分化，抑制PPAR-γ2的表達，并且與鍶鹽聯用治療股骨頭壞死效果更好；Huang Zengfa等[59]通過體內外實驗表明淫羊藿苷可以介導糖皮質激素誘導股骨頭壞死模型的PPAR-γ通路來抑制BMSCS成脂分化，但具體機制還不明確；羅遠等[60]以淫羊藿苷和骨質疏松小鼠為研究對象，發現淫羊藿苷可以抑制PPAR-γ表達。

9 cAMP/PKA通路

cAMP作為細胞內第二信使，通過調控PKA（蛋白激酶A）及其下游信號因子CREB（cAMP反應元件結合蛋白）參與腫瘤、認知功能、骨病等的調節，研究發現cAMP是介導成骨細胞表性改變的重要因子[61]。研究發現淫羊藿苷可以通過cAMP/PKA/CREB通路刺激骨形成，如Wengui Shi等[62]利用大鼠顱骨成骨細胞培養和大鼠骨生長模型，證明了淫羊藿苷通過cAMP/PKA/CREB通路刺激骨形成，且需要成骨細胞功能性初級纖毛的參與；Meng Chenc等[63]以BMP2誘導的C2C12成骨細胞為模型，發現淫羊藿苷可以激活cAMP/PKA/CREB通路來促進BMP2的表達，淫羊藿苷雖然是一種植物雌激素，但有可能并不是以其雌激素活性來調節成骨細胞的，石文貴等[64]研究淫羊藿苷處理的大鼠顱骨成骨細胞和人類乳腺癌細胞，發現淫羊藿苷雖能夠促進MCF-7細胞ERα的核轉位，但在OB細胞中淫羊藿苷卻沒有這種能力，說明淫羊藿苷并非通過經典的雌激素途徑來促進骨形成的。

實際上，由于轉錄因子可能被多個通路共享，如Runx2參與了 Wnt/β-catenin通路、OPG/RANK/RANKL通路和BMP/Smads通路等，使得通路之間會有串擾，所以淫羊藿苷發揮其藥理作用有時候不僅僅只通過一種通路，有可能是兩種甚至兩種以上，這種機制使淫羊藿苷的治療作用被放大。除了上面提到的通路之外，與骨質疏松有關的通路還有EphB/EphrinB通路、NO通路、PTH通路、FGF通路、ERα-AMPK-Sirt1通路和Nrf2通路等，但由于淫羊藿苷在這些通路方面的研究較少，所以本文不對其進行詳細描述。

10 討論

綜上所述，淫羊藿苷抗骨質疏松作用的信號通路主要有Wnt/β-catenin通路、OPG/RANK/RANKL通路、MAPK通路、Notch通路、Hedgehog通路、BMP/Smads通路、PI3K/Akt通路、PPAR-γ 通路、cAMP/PKA通路等，這些通路多且復雜，但都基本基于3種細胞——成骨細胞、破骨細胞和脂肪細胞。成骨細胞來源于間充質干細胞，主要作用是誘導新骨形成，一些重要的信號分子如 Runx2、Osx、β-catenin、AP-1等調控著成骨細胞的轉化，成骨細胞還可以通過表達其表面的RANKL，來調控破骨細胞，進而參與骨重塑；破骨細胞來源于造血干細胞，通過分泌蛋白水解酶和鹽酸來誘導骨吸收，一些炎性細胞因子，如IL-1、TNF-α等可以調節破骨細胞的分化和功能，當RANK與其配體結合后，MAPK、AKT/PKE等通路會被激活，來調節破骨細胞相關基因的表達；同樣來源于間充質干細胞的脂肪細胞會和成骨細胞競爭，表達RANKL來促進破骨細胞的形成，PPAR-γ作為成脂轉錄因子，可以下調骨髓間充質干細胞和骨髓間充質干細胞的Wnt/β-連環蛋白信號通路，分別導致成骨細胞生成抑制和破骨細胞功能激活。

在臨床應用上，淫羊藿苷可以顯著提高骨密度，曾雪等[65]將90例骨質疏松癥患者分為對照組和試驗組，對照組給予骨化三醇軟膠囊，試驗組給予淫羊藿，30 d為一個療程，三個療程之后，發現試驗組第4腰椎、股骨頸、橈骨遠端骨密度大于對照組，表明淫羊藿可以顯著提高患者骨密度。

除了具有抗骨質疏松的作用，淫羊藿苷還可以保護神經系統、保護心血管系統、提高免疫力等，具有很大的開發潛力。但也有一些不足，比如藥動學實驗發現淫羊藿苷在人體內未檢測到原型，而在動物體內可以檢測到，所以淫羊藿苷具體是如何代謝的還需要進一步研究，淫羊藿苷發揮藥理作用時，信號通路變化的上下游效應因子還有待揭示，并且淫羊藿苷的有效劑量和安全性還有待考證，需要大量臨床數據支持。