甘草養(yǎng)陰湯在改善小鼠銀屑病樣皮損和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的作用*

吳惠梅 ，陳永 ，肖長虹 ，Kutty Selva Nandakumar

（1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南方醫(yī)科大學(xué)-卡羅林斯卡研究所聯(lián)合炎癥研究中心，廣州 510515；2.深圳市人民醫(yī)院（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院、南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院）風濕免疫科，深圳 518020；3.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風濕科，廣州 510315）

銀屑病是由遺傳和環(huán)境因素共同導(dǎo)致的一種免疫介導(dǎo)的慢性、炎癥性、全身性疾病[1]。銀屑病患病率高且容易復(fù)發(fā)；歐洲和北美的患病率約為2%[1]，在丹麥為7.9%[2]。除了全身皮膚病變表現(xiàn)外，銀屑病患者罹患心血管疾病、代謝綜合征和銀屑病關(guān)節(jié)炎的風險也增加[3]。盡管目前臨床運用多種免疫抑制劑或者生物制劑，但療效仍不盡人意，并且當前治療方式多會帶來一系列不良反應(yīng)，極大影響患者的生活質(zhì)量[4]。

銀屑病在中醫(yī)被稱為“白疕”，而中藥用于銀屑病患者的治療具有悠久的歷史淵源[5]。根據(jù)中醫(yī)理論：“血熱生風”是常見的銀屑病的辨證類型。中醫(yī)上選擇了具有陰、涼性質(zhì)的藥物來治療銀屑病。盡管現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)能夠提取中草藥的一些有效成分，但在臨床實踐中，以中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床處方的基本原則[6]?；谥兴幣浞郊爸胁菟幊煞值墓π?，結(jié)合中醫(yī)配伍原則，設(shè)計出包含甘草、人參、干姜、蒲公英、羅漢果、玉竹、大棗7種中藥成分（專利申請?zhí)枺?01910843519.9）的滋陰中藥，并將其命名為“甘草養(yǎng)陰湯（GNY）”。該配方的中草藥提取物的抗炎功能有大量研究報道。例如，甘草中的二氫磺基苯甲酸酯能夠穩(wěn)定自由基的產(chǎn)生、并通過減少人類全血樣本中的血栓烷 B2（TXB2）和前列腺素 E2（PGE2）的釋放而顯示出抗氧化和抗炎活性[7]。甘草的提取物甘草酸苷可用于治療尋常型銀屑病且能夠調(diào)節(jié)Th17細胞（Th17）及其相關(guān)細胞因子的表達[8]。人參多糖提取物能夠抑制白細胞介素-8（IL-8）的分泌和Th1細胞的分化等[9]。人參皂苷可以調(diào)節(jié)小鼠脾臟中樹突狀細胞（DC）的不同亞群而緩解小鼠的類風濕性關(guān)節(jié)炎[10]。人參皂苷可抑制樹突細胞成熟遷移和歸巢，減少T細胞的活化[11]。針對該配方，前期在自身免疫性疾病類風濕關(guān)節(jié)炎及潰瘍性結(jié)腸炎的基礎(chǔ)研究及臨床病例中顯示治療價值[12-13]。

在本研究中，用咪喹莫特（IMQ）誘導(dǎo)了銀屑病小鼠模型，通過研究GNY對炎癥細胞和細胞因子影響，探索其治療銀屑病及其他自身免疫性疾病的的潛在作用機制，為GNY用于銀屑病等自身免疫性疾病患者的臨床試驗奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 實驗采用8周齡的BALB/c雌性近交小鼠。購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（批準號：CUMS-2018-0062-03）。SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，自由攝取水和食物。

1.2 IMQ誘發(fā)銀屑病小鼠模型 將小鼠分為4組[對照組（CTRL）、模型組（IMQ）和不同濃度藥物治療組包括GNY-2.5 g/kg和GNY-5 g/kg組]，每組8只。除對照組外，所有組的每只小鼠在背部的剃毛區(qū)局部給藥每日30 mg，連續(xù)5日的IMQ以誘導(dǎo)銀屑病[14]。使用IMQ的所有小鼠均出能現(xiàn)銀屑病樣皮膚炎癥，顯示模型建立成功。

1.3 GNY的制備 GNY的成分如下：甘草、人參、羅漢果、蒲公英、玉竹、干姜、大棗，按照比例12∶9∶12∶6∶9∶6∶18。將中藥飲片煮沸兩次，持續(xù) 1 h，然后用雙蒸餾水（ddH2O）稀釋到2.5 g/kg和5 g/kg濃度的藥液。

1.4 干預(yù)措施和癥狀評估 GNY-2.5 g/kg和GNY-5 g/kg組的小鼠在飲用水中加入相應(yīng)濃度的GNY。在第10天，當所有組中的銀屑病樣病變炎癥消退時，第二次應(yīng)用IMQ，連續(xù)5天（如圖1A所示）。使用銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）來檢測銀屑病癥狀，該評分包括：紅斑（0-4）、鱗片（0-4），皮膚厚度（0-4），總計12分。使用電子游標卡尺在特定受損皮膚區(qū)域測量皮膚厚度。

1.5 組織病理學(xué)評估 在銀屑病造模期結(jié)束時（第14天），通過肌肉內(nèi)注射 Zoletil 50（Virbac，F(xiàn)rance，20 mg/kg）使小鼠麻醉，并通過斷頸法處死。收集皮膚樣品用于組織病理學(xué)分析。通過常規(guī)步驟進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。使用×10放大倍數(shù)從每只小鼠的皮膚切片中選擇10個隨機區(qū)域來測量表皮厚度、使用Baker評分[9]來判斷銀屑病的病理學(xué)損害程度。

1.6 免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色 在銀屑病末期（第14天）收獲皮膚樣品，每組5只小鼠。用生物素抗小鼠 Gr-1（Ly6C/6G）、CD11c（Biolegend，美國）對炎癥細胞進行常規(guī)免疫組化染色。然后在顯微鏡下觀察。免疫熒光染色：皮膚樣品常規(guī)包埋并切片，然后將切片在冰上用丙酮固定10 min，然后浸入PBS中15 min。用含2%BSA的PBST（Biofroxx，德國）封閉45 min。用兔單克隆抗體轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β，Affinity Biosciences，中國）和維甲酸受體相關(guān)的孤兒受體γt（RORγt，Abcam，英國）在室溫下孵育組織1 h。然后加入熒光標記的抗兔二抗，并在室溫下孵育 60 min（碧云天，中國），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（碧云天）溶液用于細胞核染色。使用共聚焦顯微鏡（Cannon，日本）拍攝照片。

1.7 流式細胞分析 為了探索每組小鼠中Th17和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的水平，在處死小鼠后收集脾細胞。通過研磨制備單細胞懸液，并在避光環(huán)境下與抗特定細胞表面標記的抗體在冰上孵育30 min。Th17細胞用CD4+-APC和IL-17A+-PE抗體進行標記。Treg細胞用CD4+-PE，CD25+-APC，和叉頭框蛋白 P3（Forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3）+-BV570 標記。以上抗體均購置于BD Biosciences公司。使用LSR Ⅱ（BD Biosciences）流式細胞儀進行細胞分析，并使用Flow Jo軟件v 7.6（Tree Star，美國）進行結(jié)果分析。

1.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 使用Trizol（Invitrogen，美國）從皮膚中提取出總RNA，并溶解在無RNAse的RQ-DNAse水（Promega，美國）。使用PrimeScript RT試劑盒（Thermo Scientific，英國）對mRNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR反應(yīng)使用 SYBR Premix Ex Taq II TliRNaseH Plus（Takara biotech，日本）體系，使用 LightCycler 96（Roche，瑞典）熱循環(huán)儀進行PCR擴增。采用β-肌動蛋白（βactin）作為內(nèi)參，用于計算轉(zhuǎn)錄本相對表達量，并使用2-ΔΔCt算法計算相對表達水平。重復(fù)實驗三遍以確認結(jié)果。

qRT-PCR目標基因的引物序列如下所列：βactin（ACCGTGAAAAGATGACCCAG，GTACGACCA GAGGCATACAG）；TNF-α（ACGCTCTTCTGTCTACT GAACT，ATCTGAGTGTGAGGGTCTGG）；IL-6（GAG AAAAGAGTTGTGCAATGGC，CCAGTTTGGTAGCAT CCATCAT）；IL-10（CTGCTAACCGACTCCTTAATGC，GCTCCACTGCCTTGCTCTTAT）；TGF-β（ATCTCGAT TTTTACCCTGGTGGT，CTCCCAAGGAAAGGTAGGT GATAGT）；AMPK-ɑ1（TGTGGCTGGGTGTGTAAA，GGCTGTGTGTGGCATTC）；IL-17A（CCCCTAAGAAA CCCCCACG，TAAAGTCCACAGAAAAACAAACACG）；IL-17E（ACAGGGACTTGAATCGGGTC，TGGTAAAG TGGGACGGAGTTG）；IL-17F（GTCAGGAAGACAGC ACCA，AGCCAACTTTTAGGAGCA）；IL-22（CATGCA GGAGGTGGTACCTT，CAGACGCAAGCATTTCTCAG）；IL-23（AGCAACTTCACACCTCCCTAC，ACTGCTGA CTAGAACTCAGGC）。

1.9 統(tǒng)計分析 使用GraphPad Prism 8軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為均值±標準差（±s）。兩組之間使用Student t檢驗進行比較，使用 Bonferroni或Newman-Keuls校正進行單向方差分析作多次比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GNY改善小鼠銀屑病的臨床癥狀、減輕角質(zhì)細胞過度增厚 實驗方案如圖1A所示。在對BALB/c小鼠用IMQ誘導(dǎo)5 d后（圖1A），皮膚出現(xiàn)典型的紅斑、鱗屑和厚度增加，且總PASI高達7分，表明咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病模型成功建立。GNY能夠在4，5，6 d及IMQ二次免疫后顯著降低紅斑評分。GNY-2.5 g/kg和GNY-5 g/kg組能夠在第4～6天，第14天顯著降低鱗屑評分（P<0.05）。GNY-2.5 g/kg組在第 10、11、13、14 天降低皮膚厚度（P<0.05）。即GNY能夠在第1次IMQ誘導(dǎo)的銀屑病高峰期（第4～6天）及IMQ二次免疫后顯著性的降低銀屑病評分，且在第2次IMQ誘導(dǎo)后，GNY的治療效果更加明顯，且GNY-2.5 g/kg組治療效果優(yōu)于GNY-5 g/kg組（圖1B）。IMQ二次免疫后第14天的小鼠背部皮膚圖片證明以上特點（圖1C）。

圖1 GNY改善小鼠IMQ誘導(dǎo)的銀屑病癥狀

在兩個治療組（GNY-2.5 g/kg和GNY-5 g/kg）中，皮膚病變的HE染色顯示表皮增厚、棘皮癥、角化不全比模型組低（圖1D）。同時，GNY湯治療組能夠顯著性降低上皮的浸潤程度厚度（圖1E）和組織的病理評分（圖1F）。

2.2 GNY降低皮膚中Gr-1，CD11c和RORγ t陽性細胞的表達 粒細胞受體-1（Gr-1）是一種髓樣分化抗原，在粒細胞和巨噬細胞上表達的糖基磷脂酰肌醇（GPI）相關(guān)蛋白[15]，參與自身免疫性疾病的發(fā)病機制[16]。CD11c在單核細胞和巨噬細胞上與CD1c（BDCA-1）共表達。真皮髓樣CD11c+DC可激活CD4+T細胞并進一步誘發(fā)銀屑病的炎癥反應(yīng)[17]。在本研究中，觀察到銀屑病模型小鼠比對照組小鼠表達更高水平的Gr-1和CD11c，而GNY以劑量依賴性方式降低了它們的表達（圖2A和B）。研究顯示在銀屑病中Th17細胞產(chǎn)生IL-17A細胞因子，這可以通過RORγt進行特異性標記[17]。在銀屑病模型小鼠的真皮中，觀察到RORγt陽性細胞的存在（1～3個細胞/切片），而在對照和GNY藥物處理的小鼠中均未見RORγt陽性細胞（圖2C）。TGF-β可促進Th17細胞發(fā)育[18]。本研究顯示與健康小鼠相比，銀屑病模型小鼠表達更高數(shù)量的TGF-β+細胞。在GNY作用下降低了TGF-β+細胞的表達（圖2C）。

圖2 GNY抑制IMQ誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型中的非特異性和特異性免疫細胞

2.3 GNY調(diào)節(jié)脾臟的Treg和Th17細胞 脾臟T細胞亞群的結(jié)果表明，模型小鼠CD4+IL-17+Th17細胞百分比增加，而CD25+Foxp3+Treg細胞減少。Th17細胞是自身免疫和炎癥的促進劑，而Treg細胞則可以抑制這些現(xiàn)象并保持免疫穩(wěn)態(tài)[19]。在兩種濃度的GNY中，分化的CD4+IL-17+Th17細胞均顯著降低（圖3A），而脾臟中的CD25+Foxp3+Treg細胞在GNY干預(yù)后增加（圖3B）。

圖3 GNY調(diào)節(jié)脾臟Treg/Th17細胞

2.4 GNY減少小鼠銀屑病皮膚的多種炎性細胞因子表達 銀屑病患者血清中細胞因子，細胞因子受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)升高[20]。本研究通過qPCR實驗對皮膚樣品中IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-23、TNF-α、TGF-β 和腺苷酸活化蛋 A 激酶（AMPactivatedproteinkinase，AMPK-ɑ1）的相對mRNA表達水平進行了半定量分析。發(fā)現(xiàn)，除IL-10外，模型小鼠的血清中所有這些mRNA均升高，而GNY治療后可顯著降低炎癥因子及AMPK-ɑ1表達（圖 4）。

圖4 GNY降低牛皮癬小鼠模型真皮中的炎癥細胞因子水平

3 討論

自擬方GNY，是根據(jù)中醫(yī)理論、藥物的性味、歸經(jīng)，結(jié)合多位中醫(yī)學(xué)專家意見進行討論擬定的針對自身免疫性疾病的中藥復(fù)方。方中甘草益氣補中，清熱解毒為君藥；人參補氣、生津，玉竹養(yǎng)陰潤燥，協(xié)調(diào)甘草作用，并消除其水鈉潴留的副作用，為臣藥。蒲公英、羅漢果清熱解毒，干姜溫中散寒，回陽通脈，屬于佐藥；大棗養(yǎng)血安神、緩和藥性為使藥。整個配方陰陽調(diào)和、滋陰為主，陰中求陽；對機體的陰陽失調(diào)形成了“緩沖液”樣作用。

根據(jù)GNY所含成分的功效，主要是滋陰?！瓣柨骸痹谥嗅t(yī)診斷中可表現(xiàn)為“上火”，即過多的陽氣或心火旺盛與自身免疫反應(yīng)或炎性癥狀相關(guān)。IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠是研究自身免疫和炎性疾病的代表性動物模型，在一定程度上可以看作是上火、陰虛陽亢的模型。在本研究中，GNY該模型臨床表現(xiàn)和角質(zhì)形成、細胞增殖有明顯改善作用。非特異性和特異性免疫反應(yīng)在銀屑病發(fā)病機理中起到重要作用[23-24]，所以本研究初步探索了GNY的治療機制，涉及非特異性和特異性免疫反應(yīng)。結(jié)果證實，治療組在用藥后炎癥反應(yīng)減輕，Gr-1、CD11c和RORγt陽性細胞降低。Gr-1是在粒細胞和巨噬細胞上表達的特異性標記。CD11c主要在非特異性免疫細胞如單核細胞、DC、粒細胞、NK細胞以及T細胞和B細胞的亞群上表達，它是用于鑒定皮膚髓樣DC的最顯著的表面抗原[26]。研究顯示銀屑病皮膚真皮中CD11c+髓樣DC的數(shù)量增加，在銀屑病的發(fā)病機理中具有重要作用[27]。RORγt在Th17細胞的分化、維持和功能中起關(guān)鍵作用，并且是治療IL-17介導(dǎo)的自身免疫性疾病的重要靶標[28]。在本研究中，觀察到僅在模型組的真皮中存在RORγt陽性細胞，而在健康對照組和GNY治療組中未能發(fā)現(xiàn)RORγt陽性細胞。

銀屑病患者中存在TGF-β信號的失調(diào)[29]，TGF-β促進Th17細胞的發(fā)育[27]。本研究發(fā)現(xiàn)GNY可降低IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠皮膚中TGF-β的表達。據(jù)此推測Th17細胞可能是GNY治療銀屑病的作用機制的靶細胞之一。通過流式細胞儀分析了Th17細胞的百分比，結(jié)果顯示在用GNY治療后，該群細胞顯著減少。CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞對銀屑病炎癥發(fā)揮調(diào)控作用[30]。在本研究中，模型組中的CD25+Foxp3+Treg細胞減少，GNY給藥組顯著增加。

本研究還觀察了IL-17A和IL-6、IL-10、IL-22、IL-23、TGF-β和TNF-α等mRNA基因的表達變化。這些靶點均與IL-17形成密切的通路關(guān)系[31-33]。除IL-10外，研究證實GNY可以下調(diào)此類炎癥因子水平。此外，還測試了AMPK/IL-17信號通路，AMPKɑ1在自身免疫反應(yīng)中會增加，并通過調(diào)節(jié)代謝水平發(fā)揮一直炎癥的作用[34]，并且在炎癥反應(yīng)控制后趨于正常水平[35]。在本實驗中，銀屑病小鼠模型中GNY治療后AMPK-ɑ1的mRNA的升高水平顯著降低，這說明炎癥水平得到了較好的控制。

本研究使用IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型，分析了自擬方GNY的治療效果。研究結(jié)果顯示PASI分數(shù)的降低，證實GNY湯的有效性。免疫組化、免疫熒光、流式細胞技術(shù)和qPCR分析進一步揭示了其效率和作用機理。因此，本研究顯示了GNY對動物模型的出色療效，證實了抗炎反應(yīng)。這些結(jié)果將成為使用GNY湯治療銀屑病設(shè)計未來臨床試驗基礎(chǔ)。