96 個大白菜品種根腫病抗性鑒定及位點檢測

魏小春，原玉香，趙艷艷，楊雙娟，王志勇，蘇賀楠，李軍黨，李 林，牛劉靜，張曉偉

（1.河南省農業科學院園藝研究所 鄭州 450002； 2.鄭州大學農學院 鄭州 450001）

大白菜原產于中國北方，是我國重要的露地蔬菜，素有菜中之王的美稱。根腫病是由鞭毛菌亞門蕓薹根腫菌（Woron）侵染引起的土傳病害，在許多國家都有發生。根腫菌通過感染十字花科植物的根部，使之形成腫瘤或腐爛，最終導致整株植物枯萎甚至死亡。

隨著大白菜根腫病逐年加重，化學、生物及農業措施在防治根腫病中的效果呈下降趨勢。從生態環境方面考慮，培育抗病品種將是解決根腫病的有效方法。目前，在大白菜和歐洲蕪菁上已定位了32 個抗根腫病位點：、、、、、、、、等。研 究 較 多 的 是、、、、、位點。其中，、和CRb抗病基因已成功克隆且都為TIR-NB-LRR 類抗病基因。抗病基因的克隆和抗病位點的鑒定為培育更好的大白菜抗病品種提供了依據。河南省新野縣大白菜種植面積較大，其面臨根腫病的困擾日益嚴重，目前主要的根腫病菌株是4號生理小種新野新菌和新野老菌。在本研究中，筆者利用新野老菌及新野新菌病原菌對96個大白菜材料進行接菌鑒定，同時，利用已報道的、、、、、等6 個標記對大白菜品種進行抗性位點檢測，明確不同位點與根腫病抗性的關系，進而為選育抗根腫病大白菜資源提供分子標記基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2020 年9—11 月在河南省新野縣河南省農業科學院園藝研究所葉類蔬菜研究室根腫病原圃開展試驗，根腫病菌株分為新野老菌4 號生理小種和新野新菌4 號生理小種，96 份大白菜材料由河南省農業科學院園藝研究所葉類蔬菜生物育種課題收集保存（表1）。

表1 供試的96 個大白菜品種

續表1

1.2 方法

試驗材料的種植及鑒定均在河南省農科院園藝所新野縣根腫菌病原圃進行，其中AKIMEKI 為抗病對照，Chiifu 和ECD05 為感病對照，每份大白菜品種種植36 棵。筆者采用苗期穴盤人工接種鑒定方法，設置了3 次重復，制備1×10個·mL的根懸浮液，并使用灌根法在播種當天及播種后第3天進行接菌處理。30 d 后，開始對每株材料根部發病程度進行分級調查記錄發病情況，并利用、、、、、等6 個抗根腫病位點標記進行基因型鑒定。

1.3 根腫病抗病性鑒定及病情分級

試驗材料接菌處理30 d 后調查發病情況，計算病情指數，評價品種的抗性。大白菜根腫病的鑒定標準如下（表2）。

表2 大白菜根腫病發病級別鑒定標準

病情指數（DI）和病株率的計算公式如下：

病情指數=［Σ（各級病株數×相應級別）/（調查總株數×發病最高級別代表值）］×100。

病株率=（病株數/調查株數）×100%。

病情指數的劃分標準為：高抗≤30.0；30.0＜抗病≤40.0；40.0＜低抗/低感≤50.0；50.0＜感病≤80.0；高感＞80.0。

1.4 根腫病抗病基因檢測

使用改良后的CTAB 法提取大白菜基因組DNA，PCR 反應總體積為20 μL，根腫病抗病位點、、、、、引物、PCR 體系及反應條件見表3。

表3 各個引物PCR 反應程序要求

2 結果與分析

2.1 大白菜品種抗病性鑒定

根據苗期接菌發病情況，將96 份大白菜劃分為3 種不同的抗性類型：抗新野老菌和新野新菌類型，抗新野老菌不抗新野新菌類型，不抗新野老菌和新野新菌類型。其中抗新野老菌不抗新菌品種的比例高達61.46%，分別為秋利皇、金錦、CR-啟航等59 個品種；抗新野老菌和新野新菌品種比例為33.33%，分別為山地王2 號、燦光CR-65、冬福春寶等32 個品種；不抗新野老菌和新野新菌品種比例為5.21%，分別為吉紅娃娃、德高榮耀、玲瓏二號等5 個品種（表4）。

2.2 大白菜品種抗病基因型鑒定

利用、、、、、等6 個根腫病抗病位點分子標記對96 個大白菜品種進行抗病基因型鑒定，瓊脂糖凝膠檢測結果如下（表4）：：57 個品種檢測到抗性位點，占全部材料的59.38%；：60 個品種檢測到抗性位點，占全部材料的62.50%；：20 個品種檢測到抗性位點，占全部材料的20.83%；：14 個品種檢測到抗性位點，占全部材料的14.58%；：50 個品種檢測到抗性位點，占全部材料的52.08%；：4 個品種檢測到抗性位點，占全部材料的4.17%。部分瓊脂糖電泳結果見圖1 所示。

圖1 24 個大白菜品種基因位點的瓊脂糖凝膠電泳結果

不同大白菜品種的抗病位點存在較大差異，供試的96 個品種中CR 相春、春美二號、天香65 未檢測到抗病位點；Chiifu、寶根王（北京）、勝根CR1、根白金、西由鐵根605 檢測到抗病位點；CR 根寶、天籟、文鼎春寶、膠研CR65 檢測到抗病位點；春美一號、金童四季、寶根王（韓國）、申榮八號、CR-578、韓峰、春錦檢測到抗病位點；山地王2號B 型，CR 冬圣檢測到抗病位點，這類只檢測到單一抗病位點或者未檢測到抗病位點的材料約占全部材料的21.88%。AKIMEKI、CR 白菜12-101、CR-元春等57 個品種同時含有，抗病位點，約占全部材料的59.38%。同時這57 個品種的一部分又檢測到抗病位點（如希望白菜F），抗病位點（如農科一號），抗病位點（如金錦）；另有18.74%的品種同時包含、抗病位點（如西由鐵根CR108）或者、抗病位點（如西由鐵根705）。96 個大白菜品種大多能檢測到2 至4 個抗病位點，其中CR 春福含有的抗病位點最多，包含5 個，分別是、、、、（表4）。筆者推測含有較多抗病位點的品種在理論上會對多個根腫病生理小種表現抗性，對單一生理小種的抗性也會更強。

表4 96 個大白菜品種分子標記鑒定及病情指數分析

續表4

3 討論與結論

大白菜抗病與感病性狀與所含抗病基因具有一定的對應關系，目前，在大白菜和歐洲蕪菁上已定位32 個抗根腫病位點：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、Rcr9、、、、、、、、、、、CRb。雖然已經發現了幾十個抗病位點，但是目前研究較深入的就只有、、、、和這6 個抗病位點。其中，、、、這4 個抗性位點對4 號生理小種具有抗性。

本次試驗中農科一號、山地王1 號、春美一號、春美二號、山地王2 號、山地王2 號B 型、燦光CR-65（原名星光白菜）、寶根王、BDA202、余慶、春盛CRR、冬福春寶、金童四季、改良金童春秋、BCC-515、寒玉90、申榮8 號、CR 春泰、CR 春福、勝根CR1、根白金、CR 皇春3 號、早春の大將、屠龍CR、CR 春美609、韓峰、懷春、天籟、春錦、奇山抗根56、小黃龍等31 個品種對新野老菌和新菌均表現出抗性，這些材料大多含有和抗病位點，個別品種含有、、或抗病位點。可以看出和基因對于品種抵抗新野老菌和新菌很重要。而含有抗病位點的大白菜品種如Chiifu、德高榮耀、吉紅娃娃、玲瓏二號對新野老菌和新菌卻表現出感病癥狀，筆者推測基因可能不是主要的抗病基因。前人研究發現，由于田間存在多致病型生理小種，且隨著生理小種菌源的變異，很多具有抗性位點的抗病大白菜品種的抗性也在迅速丟失。在本次試驗中秋利皇、金錦、CR-啟航等59 個品種只抗新野老菌而不抗新菌，發生抗性丟失的現象，且所占比例高達61.46%。對品種進一步檢測發現只含有位點的山地王2 號B 型卻對新野老菌和新菌都表現出抗性，說明在該材料中可能含有新的抗病基因。

分子標記檢測結果可以從理論上揭示品種抗病的原因。筆者通過對96 個大白菜品種進行苗期抗性鑒定和抗性位點檢測，發現大白菜品種中含有較多抗性位點的品種，如AKIMEKI、冬福春寶、改良金童春秋等對新野老菌和新菌都表現出抗病，筆者推測含有較多抗病位點的品種在理論上會對多個根腫病生理小種表現抗性，對單一生理小種的抗性也會更強。下一步，筆者將進一步利用已報道的根腫病抗病位點，依據現有的種質資源，進一步鑒定出具有多根腫病抗性位點的品種，篩選出具有高抗病性，對生理小種抗性持久的育種材料。

筆者通過對96 個大白菜品種進行根腫病抗性鑒定和抗根腫病位點檢測，發現含有，和抗病位點的材料對新野老菌和新菌均表現出抗性，但只含有和抗病位點的大白菜品種對新野老菌或新菌卻表現出感病癥狀，筆者推測和或許不是主要的抗病位點。另外筆者發現只含有位點的山地王2 號B 型卻對新野老菌和新菌表現出抗性，說明其可能含有新的抗病基因。研究結果為大白菜抗根腫病種質資源鑒定以及大白菜抗根腫病育種奠定了材料基礎。