毒龍丹中馬錢子炮制前后主要成分含量變化的UPLC法分析*

馬 鵬，張遠(yuǎn)哲，黃寧川

(1 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550000；2 貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

中藥馬錢子源于馬錢科植物馬錢StrychnosnuxvornicaL．或云南馬錢S.pierrianaA．W.Hill 的干燥成熟種子，始載于《本草綱目》，性溫味苦，歸肝、脾經(jīng)，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫的功效。馬錢子主要有效成分為馬錢子堿和士的寧，隨著馬錢子的藥理研究的深入以及臨床應(yīng)用的推展[1]，馬錢子的炮制研究日益得到重視。馬錢子的傳統(tǒng)炮制，有砂燙、油制、醋制、童便制、奶制等[2]，康世奇等[3]運(yùn)用文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)對(duì)中藥馬錢子研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，提示“減毒增效”將是馬錢子未來深入研究的重要方向。基于“減毒增效”的目的，以及近年來興起的藥物合制法，如桂枝、白術(shù)、蘇木等制馬錢子[4]，這些辦法基本都屬于單一輔料炮制。

毒龍丹是民國時(shí)期著名中醫(yī)學(xué)家張覺人先生首創(chuàng)的馬錢子炮制方法[5]，被稱為“玄門四大丹”之一，毒龍丹主要是以馬錢子為主要原料，配伍五石、五豆、童便、甘草等合制而成，可以稱為馬錢子多輔料炮制方法的代表性方法之一。經(jīng)過合理配伍，臨床上用于治療內(nèi)、外、婦、五官等科的病種可達(dá) 200余種。周學(xué)平等研究指出：以多種輔料的“異類相制”炮制法可以影響中藥有毒物質(zhì)成分的溶出，可以影響有毒物質(zhì)內(nèi)外源代謝通路，可以影響藥物毒性成分結(jié)構(gòu)變化，可以增強(qiáng)機(jī)體系統(tǒng)的保護(hù)能力等，是傳統(tǒng)中藥減毒配伍理論的主要內(nèi)容，有著深刻的理論內(nèi)涵，在中藥配伍減毒中發(fā)揮了重要作用[6]。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道毒龍丹的炮制方法與其他傳統(tǒng)炮制方法的比較研究，故本實(shí)驗(yàn)利用UPLC色譜法檢測(cè)毒龍丹中馬錢子炮制前后的主要成分的變化，為豐富馬錢子的炮制研究提供一定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀 器

Agilent 1290超高壓高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器),美國Agilent公司；OpenLab CDS色譜工作站；KQ-500E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；CPA225D 型十萬分之一分析天平，德國賽多利斯公司。

1.2 試 藥

乙腈(色譜純)，美國TEDIA；其它試劑均為優(yōu)級(jí)純或分析純；水為超純水。對(duì)照品馬錢子堿(批號(hào)MUST-21110417)、士的寧(批號(hào)MUST-21083011)，曼斯特生物科技有限公司，純度均達(dá)到98%以上。馬錢子樣品購自成都荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院羅君主任鑒定為馬錢科植物馬錢StrychnosnuxvornicaL.的干燥種子。丹砂、雄黃、曾青、白礬、磁石等五種礦物藥材購自成都荷花池藥材市場(chǎng)，白扁豆、赤豆、綠豆、黃豆、黑豆購自當(dāng)?shù)卮笮瓦B鎖超市。童便收集于健康學(xué)齡男性兒童，經(jīng)衛(wèi)生學(xué)檢查符合標(biāo)準(zhǔn)。生甘草樣品購自當(dāng)?shù)赝侍盟幍辍?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(2.1mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)- 純水(B)(0.2%的甲酸溶液)梯度洗脫， 0～5 min，10% A；6～10 min，10→20% A；10～20 min， 20→80% A；20～30 min，80% A。流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長260 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，馬錢子堿、士的寧之間以及與其他組分之間分離度良好，馬錢子堿、士的寧的理論塔板數(shù)均>5000。

圖1 混合對(duì)照品(A)和毒龍丹樣品(B)UPLC圖

本文考察了乙腈-水、乙腈-水(0.2%甲酸溶液)，甲醇-水、甲醇-水(0.2%甲酸溶液)， 乙腈-水-三乙胺、甲醇-水-三乙胺等6種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示以乙腈-水(0.2%甲酸溶液)為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫的分離度較好(R>1.5)，保留時(shí)間較好，峰形分離度較好。

2.2 毒龍丹的制備

制法：先將馬錢子用童便、五石、五豆浸泡之，浸泡時(shí)間二十日。五石即丹砂、雄黃、曾青、白礬、磁石等，稱五石散；五豆即扁豆、赤豆、綠豆、黃豆、黑豆等。浸泡過程中豆須發(fā)芽，但不可發(fā)得太長，以約3 cm許即行，扁豆的體積較大，發(fā)芽較遲，故必須早二、三日入浸，才能及時(shí)。五石則打如米粒大小。馬錢子泡浸時(shí)，有幾個(gè)階段的變化，初時(shí)黃色，次呈暗紅色，到暗紅色時(shí)，即取出一粒視之，如中心變白色者，即為合度之證。此時(shí)即全部取出，逐粒刮去皮毛后，加入甘草水中，煮3 h，取出曬干，干后全部都呈黑色，碾成細(xì)末，備用。

本研究中毒龍丹基礎(chǔ)輔料采用的五石、五豆分別具有“青、赤、黃、白、黑”五種顏色，蘊(yùn)含中醫(yī)五行生克制化意義；而甘草性味甘平，具有和調(diào)百藥解毒的功效，童便性味咸寒，綠豆、赤豆有清熱解毒利濕的功效，這些炮制輔料具有降解馬錢子中一些毒性劇烈的成分的作用；而童便咸寒，可以滋陰降火，涼血散瘀，與五石中礦物質(zhì)大多具有清心瀉熱、涼肝止痙等功效的藥物一起，可以在臨床使用過程中有效發(fā)揮多靶點(diǎn)拮抗馬錢子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等毒性作用。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取對(duì)照品馬錢子堿5 mg、士的寧6 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解制成每1 mL含馬錢子堿500 μg、士的寧600 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱中保存，備用。取混合對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋5倍，即得馬錢子堿、士的寧質(zhì)量濃度分別為103.6、127.9 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

稱取干燥毒龍丹樣品粉末(過5號(hào)篩)0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量。于25 ℃超聲30 min，冷卻，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，靜置60 min取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液即得。

本文為了考察了不同溶劑的提取效率，采用了單因素變量法進(jìn)行考察，分別考察不同甲醇、乙醇、甲醇-水-鹽酸溶液，不同的提取方法回流提取、索氏提取、超聲提取、冷浸法，不同提取時(shí)間時(shí)間10、20、30、40、50, 60 min; 不同提取液體積10、20、25、30、40、50 mL對(duì)馬錢子中馬錢子及士的寧提取效率的影響。 結(jié)果表明： 馬錢子及炮制品約0.5 g，用甲醇溶液，提取液體積25 mL，超聲提取時(shí)間 30 min，提取率最高，且含量穩(wěn)定，重復(fù)性好，故最終確定此方法提取。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取 “2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 1、2、4、6、8 mL分別稀釋到 10 mL容量瓶中，定容。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取 10 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，以各對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，結(jié)果見表1所示。

表1 回歸方程及線性范圍

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一混合對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分的峰面積。結(jié)果馬錢子堿、士的寧峰面積RSD分別為0.88%、0.56%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一毒龍丹樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積。結(jié)果馬錢子堿、士的寧峰面積RSD分別為1.03%、0.79%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積。結(jié)果馬錢子堿、士的寧峰面積RSD分別為1.18%、0.62%,表明供試品溶液于24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的馬錢子樣品6份，每份1 g，分別精密添加與樣品中含量相當(dāng)?shù)鸟R錢子堿、士的寧對(duì)照品，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算各成分的平均加樣回收率。經(jīng)計(jì)算，馬錢子的平均回收率為99.63%，RSD值為0.3%；士的寧的平均回收率為99.85%，RSD值為0.5%，表明本方法的回收率良好。

2.10 樣品含量測(cè)定

取生馬錢子、毒龍丹適量，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法每批樣品平行制備3份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，根據(jù)線性方程計(jì)算馬錢子堿、士的寧的含量，結(jié)果見表2所示。

從表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，采用毒龍丹的馬錢子炮制方法后，馬錢子中的馬錢子堿和士的寧均得到明顯的下降，從試驗(yàn)層面揭示了毒龍丹的臨床使用安全的初步原因。

表2 含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本研究中毒龍丹中的馬錢子炮制方法，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，的確可以使馬錢子中馬錢子堿和士的寧的含量得到大幅度的下降，從而保證了馬錢子在臨床實(shí)用的安全性及有效性。本實(shí)驗(yàn)從毒龍丹中馬錢子炮制前后主要化學(xué)成分變化的角度，揭示了毒龍丹的炮制工藝具有一定的科學(xué)性和合理性。更深一層次研究比如藥理及毒理方面的試驗(yàn)有待后續(xù)的深化與補(bǔ)充。