國產那屈肝素鈣注射液在中國健康受試者中的生物等效性及安全性研究Δ

李潔，宋恒文，楊能，邵志超，錢春艷#（.常州市第一人民醫院臨床試驗機構辦公室，江蘇常州 3000；.常州千紅生化制藥股份有限公司，江蘇常州 35）

低分子肝素是應用化學或酶解方式，將肝素解聚并裂解成分子量1 000～12 000（平均4 000～6 000）的肝素片段，并以此所制成的一類分子量較小的肝素制劑[1-2]。低分子肝素的藥理作用主要包括抗凝血、抗血栓、抗炎、調節細胞增殖、抗腫瘤、預防腹部術后粘連、抗脂質代謝紊亂、抗氧自由基生成等，主要用于心腦血管疾病、腎臟疾病、肝臟疾病、產科疾病和急性胰腺炎、扁平苔蘚、癌癥的臨床治療，以及術后血栓的預防[3]。那屈肝素鈣是一種低分子肝素，由普通肝素通過解聚和分離所得，較普通肝素具有更長的半衰期（t1/2）[4]；同時，該藥具有明顯的抗凝血因子Ⅹa（anti-coagulation factorⅩa，Anti-Ⅹa）活性和較弱的抗凝血因子Ⅱa（anti-coagulation factorⅡa，Anti-Ⅱa）活性，主要用于預防和治療血栓栓塞[4]。那屈肝素鈣注射液原研藥的商品名為速碧林?（FRAXIPARINE?，注冊證號 H20181137），由愛爾蘭Aspen Pharma Trading Limited公司研發。本研究所用國產那屈肝素鈣注射液（國藥準字H20193057）由常州千紅生化制藥股份有限公司研發，根據其注冊批件的要求，本研究擬探討該受試制劑與參比制劑（原研藥）在中國健康人群中的生物等效性和安全性，為國產制劑的進一步研究和應用奠定基礎，為提高藥品可及性、節約醫藥成本提供支持。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SpectraMax Plus 384型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）、M37615型渦旋混合器（美國Thermolyne公司）、XS205型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Simplicity型純水儀（德國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究的受試制劑為那屈肝素鈣注射液（國藥準字H20193057，批號 851911010A，規格 0.6 mL∶6 150 AⅩaIU），由常州千紅生化制藥股份有限公司生產；參比制劑為那屈肝素鈣注射液（注冊證號H20181137，批號5313A，規格 0.6 mL∶6 150 AⅩaIU），由法國 Aspen Notre Dame de Bondevile公司生產。

低分子肝素（批號Batch 10，Anti-Ⅹa活性100 IU/mL，Anti-Ⅱa活性33 IU/mL）由歐洲藥品質量管理局提供，用于配制標準曲線樣品、質控樣品和其他驗證樣品；Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性檢測試劑盒均購自法國HYPHEN BioMed公司；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 血漿

健康人體檸檬酸鈉抗凝血漿（空白基質）來自武漢市傳染病醫院Ⅰ期臨床試驗研究室；混合空白基質（血漿）由5名健康人體抗凝血漿混合制得；空白溶血基質（血漿）的制備方法如下：將含檸檬酸鈉抗凝劑的全血樣品于≤-60℃條件下快速冷凍不少于30 min使血細胞破裂，解凍后于2～8℃下以2 500×g離心15 min，取上清液適量，與單一來源的空白基質混合，即得溶血體積比分別為0.25%、0.5%、1.0%、2.0%的空白溶血基質。

2 低分子肝素Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性的檢測

2.1 分析方法

使用Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性檢測試劑盒，采用發色底物法以多功能酶標儀測定人血漿樣品中低分子肝素的Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性。

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線和定量下限 取低分子肝素適量，用空白基質制備標準曲線樣品。其中，Anti-Ⅹa活性檢測所用標準曲線樣品的活性分別為0.010 0、0.050 0[定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）]、0.080 0、0.125、0.250、0.500、0.750、0.850、1.00[定量上限（upper limit of quantitation，ULOQ）]IU/mL，Anti-Ⅱa活性檢測所用標準曲線樣品的活性分別為0.010 0、0.018 0（LLOQ）、0.040 0、0.060 0、0.080 0、0.120、0.160、0.200（ULOQ）IU/mL。檢測波長為405 nm，參比波長分別為450 nm（Anti-Ⅹa活性）和455 nm（Anti-Ⅱa活性）。采用SoftMax?Pro GxP 5.4.1軟件進行數據采集，采用Watson LIMS 7.4.1軟件對理論活性值與所測平均光密度（optical density，OD）值進行回歸，采用五參數法對標準曲線所有有效活性水平樣品進行邏輯擬合，權重因子為1。本方法通過驗證的定量范圍分別為0.050 0～1.00 IU/mL（Anti-Ⅹa活性）和0.018 0～0.200 IU/mL（Anti-Ⅱa活性）。

2.2.2 準確度與精密度 準確度與精密度評估將采用6個驗證分析批，由2名實驗人員在2 d內完成。每個準確度和精密度驗證分析批包含1套新鮮配制的標準曲線樣品和空白對照樣品以及5套5個活性水平的質控樣品，其中Anti-Ⅹa活性檢測所用質控樣品的活性分別為1.00（ULOQ）、0.800[高 濃度 質控（high quality control，HQC）]、0.400[中濃度質控（moderate quality control，MQC）]、0.100[低濃度質控（low quality control，LQC）]、0.050 0（LLOQ）IU/mL，Anti-Ⅱa活性檢測所用質控樣品的活性分別為 0.200（ULOQ）、0.150（HQC）、0.100（MQC）、0.050 0（LQC）、0.018 0（LLOQ）IU/mL。按“2.2.1”項下方法檢測并處理數據，結果見表1。由表1可見，在本方法條件下，Anti-Ⅹa活性和Anti-Ⅱa活性的批間和批內準確度和精密度均符合相關標準[5]。

表1 Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性檢測方法準確度與精密度試驗結果（n＝5或n＝6）

2.2.3 基質效應 取空白基質和混合空白基質，按“2.2.1”項下方法分別制備ULOQ、LLOQ樣品和空白基質水平選擇性樣品（Anti-Ⅹa活性：10批次；Anti-Ⅱa活性：20批次）。結果顯示，在本方法條件下，在定量范圍內未見明顯的基質效應。

取空白溶血基質（Anti-Ⅹa活性檢測所用溶血基質的溶血體積比分別為0.25%、0.5%、1.0%，Anti-Ⅱa活性檢測所用溶血基質的溶血體積比分別為0.25%、0.5%、1.0%、2.0%）和混合空白基質，按“2.2.1”項下方法分別制備ULOQ、LLOQ樣品及其對應活性的空白基質水平選擇性樣品。結果顯示，當溶血體積比≤0.25%時，空白溶血基質對Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性的檢測無影響。

2.2.4 平行性 選用3個接近實測最大活性的臨床樣品考察平行性。采用混合空白基質稀釋上述樣品，且保證至少有3個稀釋度樣品的Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性落在定量范圍內。結果顯示，接近實測最大活性的臨床樣品經混合空白基質稀釋后，定量范圍內樣品活性值的CV均滿足相關標準，所有稀釋度樣品的測試結果（經稀釋倍數校正）的精密度均滿足相關標準[5]，提示臨床樣品稀釋具有平行性。

2.2.5 稀釋效應和鉤狀效應 Anti-Ⅹa活性和Anti-Ⅱa活性檢測結果顯示，在10、5倍ULOQ活性樣品中均未觀察到鉤狀效應，樣品在按最小稀釋倍數進行稀釋之前最多可以采用混合空白基質預稀釋80、32倍。

2.2.6 穩定性 標準品原始儲備液（Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性）在-90～-60℃下放置41 d穩定；將其溶于基質中，在室溫和2～8℃下放置27 h均穩定，在-25～-15℃、-90～-60℃下放置62 d均穩定，反復凍融（-80℃～室溫，下同）6次穩定。

將受試制劑（Anti-Ⅹa活性）溶于基質中，在室溫和2～8℃下放置27 h均穩定，在-25～-15℃、-90～-60℃下放置61 d均穩定，反復凍融6次穩定。將參比制劑（Anti-Ⅹa活性）溶于基質中，在室溫和2～8℃下放置27 h均穩定，在-25～-15℃、-90～-60℃下分別放置39、61 d均穩定，反復凍融6次穩定。將受試制劑（Anti-Ⅱa活性）溶于基質中，在室溫和2～8℃下放置27 h均穩定，在-25～-15℃、-90～-60℃下分別放置40、61 d均穩定，反復凍融6次穩定。將參比制劑（Anti-Ⅱa活性）溶于基質中，在室溫和2～8℃下放置27 d均穩定，在-25～-15℃、-90～-60℃下分別放置61 d均穩定，反復凍融6次穩定。

在冰水浴條件下，含標準品、受試制劑、參比制劑的人全血樣本（Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性）放置2 h均穩定。

3 2種制劑的生物等效性及安全性評價

3.1 納入與排除標準

本研究方案通過常州市第一人民醫院倫理委員會審核批準[倫理批件號（2020）藥第02號]。

健康受試者納入標準包括：（1）18周歲及以上，男女不限；（2）體質量不低于50 kg，體質量指數為19.0～26.0 kg/m2；（3）經生命體征、體格檢查，血常規、尿常規、血生化檢測，胸片（正位）/胸部CT檢查，傳染病篩查，凝血功能檢查，妊娠試驗（女性）和12導聯心電圖檢查等，各指標均無異?；虍惓５珶o臨床意義；（4）在未來6個月內無生育計劃且自愿采取有效避孕措施；（5）充分了解試驗目的、性質、方法和可能發生的不良反應，自愿參與本研究并簽署知情同意書，能夠按照方案要求完成試驗。

排除標準包括：（1）有過敏史（如哮喘、蕁麻疹、濕疹等）或過敏體質者，已知對本藥成分或類似物、魚精蛋白和橡膠過敏者；（2）藥物濫用篩查陽性或酒精呼氣測試陽性者；（3）有凝血功能障礙疾病史者，或在過去6個月內發生過增加出血風險相關事件者，或既往有顱內出血、胃腸道出血、紫癜、消化道潰瘍疾病史者，或過去30 d內接受過大手術者，或有活動性病理性出血、顱內出血疾病史者；（4）經傳染病篩查出現以下任一情況者：抗人類免疫缺陷病毒抗體陽性、乙肝表面抗原陽性、抗丙肝抗體陽性、抗梅毒螺旋體抗體陽性；（5）在篩選前3個月有獻血史或失血超過400 mL者[6]。

3.2 給藥方案與血樣采集

本試驗采用開放、隨機、單劑量、兩序列、兩周期交叉設計，健康受試者采用區組隨機化方法按1∶1分配到TR（受試制劑-參比制劑）組和RT（參比制劑-受試制劑）組。受試者均禁食過夜（至少10 h），并于給藥前后禁水1 h。兩組患者均于第1周期的第1天空腹皮下注射受試制劑或參比制劑6 150 AⅩaIU，第2周期交叉給藥，清洗期為7 d。

在給藥0 h（給藥前1 h內）和給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、10、12、16、24 h采集血樣4 mL至含檸檬酸鈉的抗凝管中，輕柔顛倒混勻數次，于4℃下以2 500×g離心15 min，取上層血漿1 mL轉移至分析用凍存管中，剩余血漿轉移至備份用凍存管中。所有樣品均需在采集后120 min內完成離心，并置于-20℃冰箱中凍存。待受試者同周期血漿全部收集完成后再統一轉移至-60℃超低溫冰箱中凍存。試驗期間，所有受試者統一進食標準餐。

3.3 數據處理

將隨機化后至少服用1次藥物（無論參比制劑或受試制劑）且具有安全性評價數據的受試者納入安全性分析集；將充分依從于試驗方案且按照方案要求完成給藥、生物樣品采集和檢測分析的受試者納入符合方案集。

取各受試者血漿樣品，按“2.1”項下方法檢測后，按隨行標準曲線計算其Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性。利用WinNonlin?8.0分析軟件，采用非房室模型計算兩藥的藥效動力學參數并繪制活性-時間曲線。藥效動力學參數包括Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性最大值（Anti-Ⅹamax、Anti-Ⅱamax）、活性-時間曲線下面積（AUEC0-t、AUEC0-∞）、達峰時間（tmax）、t1/2。應用SAS 9.4軟件，對Anti-Ⅹa活性的藥效動力學參數（Anti-Ⅹamax、AUEC0-t和AUEC0-∞）進行生物等效性分析。若受試制劑與參比制劑Anti-Ⅹa活性的主要藥效動力學參數幾何均值比的90%置信區間在80.00%～125.00%內，可認為兩藥生物等效[7]。

3.4 結果

3.4.1 受試者人口學特征 本研究共納入健康受試者24例，其中男性20例、女性4例，均為漢族；身高為（170.05±6.86）cm，體質量為（64.82±6.50）kg，體質量指數為（22.41±1.83）kg/m2；所有受試者均完成全部試驗。

3.4.2 受試者給藥后2種制劑的藥效動力學參數比較24例受試者空腹皮下注射那屈肝素鈣注射液受試制劑或參比制劑后，其Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性的藥效動力學參數見表2，其活性-時間曲線見圖1（圖1B中，因Anti-Ⅱa活性在16 h后低于LLOQ，故時間范圍為0～16 h）。

圖1 受試者給予受試制劑/參比制劑后的平均血漿抗凝血因子活性-時間曲線

表2 受試制劑/參比制劑Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性的主要藥效動力學參數（n＝24）

3.4.3 生物等效性評價 兩藥藥效動力學參數（Anti-Ⅹamax、AUEC0-t和AUEC0-∞）的幾何均值比的90%置信區間分別為110.98%～123.50%、112.11%～121.24%、111.57%～120.00%。參照“3.3”項下生物等效性判定標準[7]，兩種制劑生物等效。

3.4.4 安全性評價 給藥前后，所有受試者的生命體征及心電圖檢查均未見明顯異常，有14例受試者發生不良事件，合計19例次，分級均為1級，無嚴重的不良事件發生。試驗過程中，受試者發生的不良事件包括：低鈉血癥（受試制劑使用者2例次，參比制劑使用者1例次）、尿路感染（受試制劑使用者和參比制劑使用者各1例次）、體位性低血壓（受試制劑使用者1例次）、惡心（參比制劑使用者1例次）、高尿酸血癥（受試制劑使用者5例次，參比制劑使用者1例次）、竇性心動過速（參比制劑使用者2例次）、高甘油三酯血癥（受試制劑使用者1例次）、紫癜（受試制劑使用者1例次）、斑丘疹（參比制劑使用者1例次）、血腫（受試制劑使用者1例次）。其中，血腫被判定為“肯定有關”，紫癜和斑丘疹被判定為“很可能有關”，其余不良事件均被判定為“可能無關”[8-10]。本課題組初步認為，那屈肝素鈣注射液受試制劑和參比制劑均具有良好的安全性。

4 討論

本試驗設計主要參考國家藥品監督管理局藥品審評中心《關于仿制的低分子肝素類產品新增技術要求的意見》[11]、《低分子量肝素注射液人體藥效學生物等效性研究一般考慮》[12]和美國FDA發布的低分子肝素類藥品生物等效性指導原則（如Recommended Guidance：Draft Guidance on Enoxaparin Sodium[13]）和既往文獻報道[14]，在健康受試者空腹條件下以體內藥效學（Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性）為終點進行單劑量、雙交叉的生物等效性研究。本研究采用發色底物法測定人血漿中受試制劑和參比制劑的Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性，方法學驗證結果符合2020年版《中國藥典》（四部）通則“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的相關要求[5]。

在本項以中國健康受試者為對象的那屈肝素鈣注射液隨機、開放、單劑量、兩序列、兩周期交叉的生物等效性試驗中，受試制劑與參比制劑（Anti-Ⅹa活性）的主要藥效動力學參數幾何均值比的90%置信區間均在80.00%～125.00%內，可判斷健康受試者空腹皮下注射那屈肝素鈣注射液受試制劑（0.6 mL∶6 150 AⅩaIU）與參比制劑（速碧林?，0.6 mL∶6 150AⅩaIU）生物等效。

那屈肝素鈣注射液的安全性事件主要有不同部位的出血，偶見血小板減少癥和血栓形成，極少數患者會出現皮膚壞死、注射部位小血腫、皮膚反應、全身性過敏反應（如血管神經性水腫、一過性氨基轉移酶增高）[8-10]。本試驗中，受試者發生的不良事件包括低鈉血癥、尿路感染、體位性低血壓、惡心、高尿酸血癥、竇性心動過速、高甘油三酯血癥、紫癜、斑丘疹、血腫。所有藥物相關不良事件（紫癜、斑丘疹、血腫）均為輕度，未見嚴重的不良事件發生，受試者生命體征各項指標大致保持平穩。由此表明，那屈肝素鈣注射液受試制劑和參比制劑均具有良好的安全性。與既往研究相比[14]，本項試驗基于受試者體征、體格、血常規等檢查結果，更多地關注了制劑的安全性。

綜上所述，國產那屈肝素鈣注射液與參比制劑生物等效，兩藥的安全性均較好。