金絲桃苷對帕金森病模型小鼠小膠質細胞M1/M2極化和LPS誘導的BV2細胞極化的調節作用研究

徐幸杰 潘濤 樊慧杰 肖琪 和璐璐 李艷榮 賈璐 王利然 尉杰忠肖保國 馬存根 張波 柴智

帕金森病的發病率僅次于阿爾茨海默病,是第二大中樞神經系統變性疾病,其病理特征是黑質紋狀體多巴胺能神經元的丟失和神經元蛋白質內含物“路易小體”的形成[1]。目前,帕金森病尚不能完全治愈,現代藥物治療副作用大,手術治療風險高。中醫藥治療帕金森病療效確切,近期臨床研究也表明中醫藥與現代治療相結合,能夠提高治療效果,減少不良反應的發生[2]。課題組前期研究表明中醫補腎方五子衍宗丸可以有效改善1-甲基-4-苯 基-1,2,3,6-四 氫 吡 啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導的帕金森病小鼠的步態紊亂,減輕神經炎癥和氧化應激反應,保護多巴胺神經元[3-5]。進一步的研究表明,五子衍宗丸主要活性成分金絲桃苷能夠減輕魚藤酮誘導的大鼠多巴胺神經元丟失和魚藤酮誘導的SH-SY5Y人神經母細胞瘤細胞損傷,其機制與抑制多巴胺神經元凋亡和自噬有關[6]。在此基礎上,本研究進一步探討金絲桃苷對帕金森病模型小鼠小膠質細胞和LPS誘導的小膠質細胞(簡稱BV2細胞)M1/M2極化的調節作用,觀察炎性細胞因子水平和極化相關蛋白表達變化,聚焦小膠質細胞極化,探究金絲桃苷對帕金森病模型的新機制。

1 材料與方法

1.1 金絲桃苷對帕金森病模型小鼠小膠質細胞M1/M2極化的影響研究

1.1.1 實驗動物 30只體質量為18～22 g的雄性C57BL/6小鼠(8周齡)由北京維通利華實驗動物有限公司提供,合格證號:[SCXK(京)2016-0006]。小鼠在溫度為20～25℃、濕度為40%～60%的條件下飼養1周后開始實驗。

1.1.2 試劑與儀器 金絲桃苷(分析標準品,≥98%,北京索萊寶科技有限公司,貨號SH8310);MPTP(美國Sigma公司,貨號M0896);腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)ELISA試劑盒、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,貨號ml002095、ml301814);酪氫酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylase B kinase,p-AKT)抗體(美國Cell Signaling Technology公司,貨號58844、4685);離子鈣接頭蛋白抗原(ionized calcium bindingadapter molecule 1,Iba-1)、精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)、誘導型一氧化氮合酶(inductible nitric oxide synthase,iNOS)、驢抗小鼠IgG Alexa Fluor?647、驢抗兔IgG Alexa Fluor?555抗體(英國Abcam公司,貨號ab5076、ab96183、ab49999、ab150107、ab150074);驢抗山羊IgG Alexa FluorTMPlus 488抗體(美國invitrogen公司,貨號A32814);β-actin抗體(南京Bioworld公司,貨號AP0060);辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase,HRP)羊抗兔IgG(武漢BOSTER生物工程有限公司,貨號BA1055)。多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司,型號SpectraMax Plus384),凝膠成像儀(美國Azure Biosystems公司,型號C300),熒光顯微鏡(德國Leica公司,型號DM4000B)。

1.1.3 動物分組、造模及給藥 按照隨機分配原則將小鼠分成三組:正常組、MPTP組和MPTP+金絲桃苷組,每組10只。除正常組外,其余小鼠腹腔注射MPTP建立帕金森病模型,每日1次,連續注射7天,注射劑量參考課題組前期實驗[4-5]。將金絲桃苷與聚乙二醇400按5 mg∶100μL的比例,于37℃超聲30分鐘溶解,再用生理鹽水稀釋至所需用量,現用現配。自MPTP注射第1天起,金絲桃苷組小鼠每日腹腔注射25 mg/kg的金絲桃苷溶液,每只0.2 mL,共注射2周。

1.1.4 Western blot檢測TH蛋白表達 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,生理鹽水灌注后取腦,腦組織加入蛋白裂解液在冰上研磨并裂解30分鐘,在12000 g,4℃條件下離心15分鐘,取上清液,使用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度。每孔加30μg蛋白樣品,經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳分離后,200 mA濕轉2小時至聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride,PVDF)膜,室溫下使用5%脫脂牛奶封閉45分鐘,使用TH(1∶2000)和β-actin(1∶5000)4℃孵育過夜。次日,使用加入Tween-20的Tris緩沖液洗膜后,用HRP羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育2小時,使用ECL化學發光液顯影,條帶灰度值使用Image J軟件進行分析。

1.1.5 ELISA檢測TNF-α和IL-1β蛋白含量 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,冰上快速分離腦組織,稱重后加入9倍質量的生理鹽水,冰上研磨后3000 r/15分鐘,離心取上清液,用ELISA法檢測小鼠腦組織上清液中TNF-α和IL-1β蛋白含量。

1.1.6 免疫熒光檢測小鼠腦組織Arg-1、iNOS、Iba-1和p-AKT表達 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,先使用生理鹽水,再使用4%多聚甲醛灌注后取腦,腦組織在4%多聚甲醛中固定4小時后浸入30%蔗糖溶液中脫水48小時,腦組織沉底后取出,吸干表面水分,使用包埋劑包埋腦組織,用液氮速凍組織,使用冰凍切片機進行切片,切片厚度為10μm。先使用5%BSA封閉冰凍切片,后使用Arg-1、iNOS、Iba-1和p-AKT一抗(1∶500)在4℃條件下孵育過夜,次日洗滌后使用熒光二抗(1∶500)室溫孵育切片2小時,甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察,使用Image J軟件進行光密度分析。

1.2 金絲桃苷對LPS誘導的BV2細胞的極化的調節作用研究

1.2.1 實驗細胞 BV2細胞購買于北納生物,使用含10%FBS的DMEM高糖培養基,置于37℃,5%CO2的細胞培養箱中培養,3天傳代一次。

1.2.2 試劑與儀器 金絲桃苷(分析標準品,≥98%,北京索萊寶科技有限公司,貨號SH8310),LPS(北京索萊寶科技有限公司,貨號L8880);TNFαELISA試劑盒,IL-1βELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,貨號ml002095、ml301814);AKT、p-AKT抗體(美國Cell Signaling Technology公司,貨號4060、4685);APC-CD16/32和PE-CD206抗體(美國BioLegend公司,貨號101325、141705);βactin抗體(南京Bioworld公司,貨號AP0060);HRP羊抗兔IgG(武漢BOSTER生物工程有限公司,貨號BA1055)。多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司,型號SpectraMax Plus384),凝膠成像儀(美國Azure Biosystems公司,型號C300),流式細胞儀(美國BD公司,型號BD Accuri C6 Plus)。

1.2.3 細胞分組、造模及給藥 BV2細胞分為正常組、LPS組和金絲桃苷組。LPS組使用1μg/mL的LPS刺激BV2細胞24小時,建立BV2細胞的炎癥模型,金絲桃苷組使用1μg/mL的LPS刺激BV2細胞24小時后,再使用濃度為20μg/mL的金絲桃苷干預24小時[7]。

1.2.4 流式細胞術檢測BV2細胞CD206、CD16/32陽性細胞比例 BV2細胞以1.5×106個/mL的密度接種于6孔板,用LPS刺激24小時后再加入金絲桃苷處理24小時后刮下細胞,離心后使用CD206、CD16/32抗體避光室溫染色20分鐘,洗滌3次后使用流式細胞儀檢測CD206、CD16/32陽性細胞比例。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α和IL-1β蛋白含量 BV2細胞以1.5×106個/mL的密度接種于6孔板,用LPS刺激24小時后再加入金絲桃苷處理24小時后,取各組BV2細胞上清液;用ELISA檢測各組BV2上清液中TNF-α和IL-1β蛋白含量。

1.2.6 Western blot檢測AKT與p-AKT表達 BV2細胞以1.5×106個/mL的密度接種于6孔板,用LPS刺激24小時后再加入金絲桃苷處理24小時,胰酶消化各組BV2細胞,離心后加入蛋白裂解液,置于冰上裂解30分鐘后在12000 g、4℃條件下離心15分鐘,取上清液,使用BCA法測定蛋白濃度。每孔加30μg蛋白樣品,經10%SDS-PAGE電泳分離后,200 mA濕轉2小時至PVDF膜,室溫下使用5%脫脂牛奶封閉45分鐘,細胞蛋白使用AKT、p-AKT(1∶2000)和β-actin(1∶5000),動物蛋白使用TH(1∶2000)和β-actin(1∶5000)4℃孵育過夜。次日,使用加入Tween-20的Tris緩沖液洗膜后,用HRP羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育2小時,使用ECL化學發光液顯影,條帶灰度值使用Image J軟件進行分析。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析,實驗數據為計量資料呈正態分布,且方差齊,以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較使用Tukey檢驗,P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金絲桃苷對小鼠腦TH蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,與正常組相比,MPTP組小鼠腦組織TH表達顯著降低(P＜0.01),而MPTP+金絲桃苷組小鼠TH表達顯著增加(P＜0.05)。表明金絲桃苷改善了帕金森病小鼠多巴胺能神經元的丟失。見表1、圖1。

表1 各組帕金森模型小鼠腦TH蛋白相對表達比率

圖1 各組帕金森模型小鼠腦TH蛋白表達

2.2 金絲桃苷對小鼠腦Iba-1/iNOS、Iba-1/Arg-1的免疫熒光表達和TNF-α、IL-1β蛋白含量的影響

免疫熒光結果顯示,與正常組比較,MPTP組小鼠腦黑質紋狀體區Iba-1/Arg-1雙陽性細胞數量顯著降低(P＜0.01),而Iba-1/iNOS雙陽性細胞顯著增加(P＜0.01)。與MPTP組比較,金絲桃苷+MPTP組小鼠腦黑質紋狀體區Iba-1/Arg-1雙陽性細胞顯著增加(P＜0.05),而Iba-1/iNOS雙陽性細胞顯著減少(P＜0.01)。ELISA結果顯示,與正常組比較,MPTP組小鼠腦TNF-α、IL-1β蛋白含量顯著升高(P＜0.05,P＜0.01)。與MPTP組比較,MPTP+金絲桃苷 組小鼠腦TNF-α、IL-1β蛋白含量顯著降低(P＜0.01,P＜0.01)。表明金絲桃苷能夠調節帕金森病小鼠小膠質細胞由M1型向M2型極化,改善炎癥反應。見表2、3,圖2。

圖2 各組帕金森模型小鼠腦炎癥因子表達和腦黑質紋狀體區Iba-1、Arg-1、iNOS共染

表2 各組帕金森模型小鼠黑質紋狀體區Iba-1/Arg-1和Iba-1/iNOS雙陽性細胞數比較(n=6,±s)

表2 各組帕金森模型小鼠黑質紋狀體區Iba-1/Arg-1和Iba-1/iNOS雙陽性細胞數比較(n=6,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.01;與MPTP組相比,b P＜0.05,c P＜0.01。

組別 Iba-1+Arg-1+細胞數(個)Iba-1+iNOS+細胞數(個)28.67±5.51 5.67±2.52 MPTP組 5.33±3.06a 27.33±5.03a MPTP+金絲桃苷組 20.33±3.51b 11.67±2.52正常組c

表3 各組帕金森模型小鼠腦勻漿炎癥因子含量比較(n=6,±s)

表3 各組帕金森模型小鼠腦勻漿炎癥因子含量比較(n=6,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.05,b P＜0.01;與MPTP組相比,c P＜0.01。

組別 TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL)102.10±10.50 89.87±6.20 MPTP組 124.90±6.54a 108.20±7.20b MPTP+金絲桃苷組 89.15±7.06c 89.82±10.68正常組c

2.3 金絲桃苷對小鼠Iba-1/p-AKT免疫熒光表達的影響

免疫熒光結果顯示,與正常組比較,MPTP組小鼠腦黑質紋狀體區Iba-1/p-AKT雙陽性細胞的比例顯著降低(P＜0.05)。與MPTP組比較,MPTP+金絲桃苷 組小鼠腦黑質紋狀體區Iba-1/p-AKT雙陽性細胞的比例顯著升高(P＜0.05)。表明金絲桃苷能夠增加帕金森病 小鼠腦黑質紋狀體區小膠質細胞的p-AKT蛋白表達。見表4、圖3。

圖3 各組帕金森模型小鼠腦黑質紋狀體區Iba-1和p-AKT共染

表4 各組帕金森模型小鼠黑質紋狀體區Iba-1/p-AKT雙陽性細胞比例比較(n=6,±s)

表4 各組帕金森模型小鼠黑質紋狀體區Iba-1/p-AKT雙陽性細胞比例比較(n=6,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.05;與MPTP組相比,b P＜0.05。

組別 p-AKT+細胞數(個)Iba-1+細胞數(個)Iba-1+p-AKT+細胞比例(%)2.25±1.71 13.00±2.94 33.85±2.14 MPTP組 3.00±1.41 20.75±3.78a 15.70±4.92a MPTP+金絲桃苷組 5.00±1.83 19.50±2.89a 25.79±5.21正常組b

2.4 金絲桃苷對BV2細胞CD16/32和CD206陽性細胞比率和TNF-α、IL-1β蛋白含量的影響

流式細胞檢測結果顯示,與正常組比較,LPS組BV2細胞CD16/32陽性細胞比例顯著上升(P＜0.01),CD206蛋白表達顯著降低(P＜0.01)。與LPS組比較,金絲桃苷組BV2細胞CD16/32陽性細胞比例顯著下降(P＜0.01),CD206蛋白表達顯著上升(P＜0.05)。ELISA結果顯示,與正常組比較,LPS組BV2細胞上清液中TNF-α、IL-1β蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。與LPS組比較,金絲桃苷組BV2細胞上清液TNF-α、IL-1β蛋白含量顯著降低(P＜0.01,P＜0.05)。表明金絲桃苷可減輕LPS誘導的BV2細胞的炎癥反應,調節細胞極化。見圖4,表5、6。

表5 各組BV2細胞CD16/32陽性細胞和CD206陽性細胞比例比較(n=3,±s)

表5 各組BV2細胞CD16/32陽性細胞和CD206陽性細胞比例比較(n=3,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.01;與LPS組相比,b P＜0.05,c P＜0.01。

組別 CD16/32陽性比例(%)CD206陽性比例(%)19.04±3.83 26.04±4.07 LPS組 41.53±4.74a 7.75±3.52a金絲桃苷組 19.92±4.53c 17.91±4.27正常組b

圖4 各組BV2細胞上清液中炎癥因子表達和CD16/32、CD206陽性細胞比例

表6 各組BV2細胞上清液炎癥因子含量比較(n=3,±s)

表6 各組BV2細胞上清液炎癥因子含量比較(n=3,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.01;與LPS組相比,b P＜0.05,c P＜0.01。

組別 TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL)正常組 160.32±25.11 145.84±14.93 b LPS組 398.90±22.87a 237.32±13.01a金絲桃苷組 138.74±18.18c 195.02±17.69 b

2.5 金絲桃苷對BV2細胞AKT、p-AKT表達的影響

與正常組比較,LPS組BV2細胞p-AKT/AKT的表達顯著降低(P＜0.01);與LPS組比較,金絲桃苷組BV2細胞中p-AKT/AKT的表達顯著升高(P＜0.01),表明金絲桃苷能夠增加LPS誘導的BV2細胞的p-AKT蛋白表達。見表7、圖5。

表7 各組BV2細胞p-AKT/AKT蛋白相對表達比率(n=3,±s)

表7 各組BV2細胞p-AKT/AKT蛋白相對表達比率(n=3,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.01;與LPS組相比,b P＜0.01。

組別 p-AKT/AKT(灰度比值)1.207±0.054 LPS組 0.489±0.069a金絲桃苷組 0.671±0.051正常組b

圖5 各組BV2細胞AKT、p-AKT蛋白表達

3 討論

目前,帕金森病的發病機制尚不明確。眾多研究認為,帕金森病的發生是環境因素、氧化應激、炎癥等因素共同作用的結果。神經炎癥反應對帕金森病的發生發展具有不容忽視的作用。小膠質細胞是定居在中樞神經系統的巨噬細胞,通過分泌細胞因子和吞噬功能發揮固有免疫作用,小膠質細胞介導的炎性反應是中樞神經系統炎癥反應的重要來源[8]。當組織受損或病原體入侵時,小膠質細胞會被激活并向不同的表型分化,發揮不同的作用。M1型小膠質細胞是促炎型細胞,高表達iNOS和CD16/32,吞噬能力較弱,并釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子;M2型小膠質細胞是抗炎型小膠質細胞,高表達Arg-1和CD206,吞噬能力較強,并釋放IL-10等抗炎細胞因子[9-10]。研究發現,帕金森病患者血液、紋狀體和腦脊液中的炎性細胞因子水平較正常人群顯著增加[11-13]。同時,帕金森病患者的紋狀體和嗅球中也存在大量活化的小膠質細胞,主要表型為M1型[14-15]。而促進小膠質細胞由M1型向M2型轉化,能夠減輕中樞神經炎癥,保護多巴胺神經元,改善運動功能紊亂[16]。因此,靶向小膠質細胞M1向M2轉化,進而抑制其介導的神經炎癥反應,是保護多巴胺神經元的有效方案之一。

金絲桃苷是一種黃酮類化合物,在帕金森病模型中被證實具有多巴胺神經保護作用和抗炎抗氧化作用。Seung-Hwan Kwon等[17]研究發現,金絲桃苷能夠通過激活Nrf2/HO-1通路保護6-OHDA誘導的SY5Y細胞的損傷。Wang Kai等[18]研究發現金絲桃苷通過激活MPTP誘導的帕金森病小鼠模型中的PACAP-CREB途徑減弱NLRP3炎性體介導的神經炎癥。但金絲桃苷能否調節帕金森病模型中小膠質細胞的極化從而治療帕金森病仍是未知。MPTP是一種神經毒素,能夠透過血腦屏障,隨后被單胺氧化酶B代謝為1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridine,MPP+),MPP+會被多巴胺轉運體錯誤識別并轉運進入多巴胺能神經元線粒體,與線粒體復合物I結合,隨后阻斷線粒體呼吸鏈,最終導致細胞死亡,因此被廣泛用于帕金森病的研究[16]。本研究首先使用金絲桃苷干預MPTP誘導的帕金森病小鼠模型,結果顯示金絲桃苷能夠顯著減少帕金森病小鼠黑質紋狀體多巴胺能神經元的丟失,且顯著減少了小膠質細胞M1型(Iba-1+iNOS+)的數量,增加了M2型(Iba-1+Arg-1+)的數量,并降低了炎性細胞因子的表達,表明金絲桃苷能夠促進小膠質細胞由M1型向M2型轉化,進而抑制中樞神經炎癥。

PI3K/AKT/mTOR通路調節巨噬細胞的存活,遷移和擴散,但也協調響應巨噬細胞中的不同代謝和炎癥信號。PI3K/AKT/mTOR通路可被TLR4、Fc受體、細胞因子等激活,進而激活下游信號分子產生細胞因子[19]。激活或過表達AKT激酶可減少小膠質細胞的活化;AKT激活可促進小膠質細胞M2型編碼基因的上調[20]。此外,抑制AKT2可以減少巨噬細胞的吞噬作用[21]。動物實驗顯示金絲桃苷顯著提高了帕金森病小鼠小膠質細胞AKT的磷酸化水平,這表明金絲桃苷調節小膠質細胞極化或許與促進AKT蛋白磷酸化有關。

為了進一步明確金絲桃苷促進小膠質細胞極化的作用,在證實金絲桃苷對帕金森病小鼠的治療作用后,課題組使用金絲桃苷干預LPS誘導的BV2細胞炎癥模型。BV2細胞是一種永生化小膠質細胞系,實驗中常用LPS誘導BV2細胞活化模擬中樞神經小膠質細胞炎癥反應。課題組的研究結果顯示,金絲桃苷顯著抑制了LPS誘導的BV2細胞M1型標記物CD16/32的表達,并促進M2型標記物CD206的表達,ELISA結果顯示金絲桃苷顯著減少了促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的蛋白含量。此外,Western blot結果金絲桃苷顯著增強了LPS誘導的BV2細胞AKT蛋白的磷酸化水平。這些結果表明,金絲桃苷能夠靶向小膠質細胞表型由M1型轉化為M2型,減輕小膠質細胞介導炎癥反應,其作用機制可能與促進AKT蛋白磷酸化有關。

綜上所述,研究證實金絲桃苷能夠調節小膠質細胞極化,減輕小膠質細胞炎癥反應,可能與其激活AKT信號有關,為金絲桃苷治療帕金森病的機制研究提供了新思路。但金絲桃苷對于小膠質細胞吞噬能力及整個AKT信號通路的影響還有待進一步研究。