miR-146a-5p、miR-23a-3p 與阿爾茨海默病及認知功能障礙的相關性

馬玉柱，鄒文靜

阿爾茨海默病（AD）是一種中樞神經系統和退變性疾病，以認知功能障礙為主要臨床特征，認知功能的缺損往往會涉及記憶、學習、執行等多個認知域。微小核糖核酸（miRNA）在神經細胞分化、凋亡、增殖等生物學過程中發揮了廣泛而重要的作用。miRNAs 參與可塑性的調節，并與記憶和學習有關，作為AD認知功能的風險預測因子具有巨大潛力[1]。研究推測海馬中特異性miRNA 表達可作為一種中介機制參與突觸功能的損害過程，使腦代謝和腦電生理活動發生改變，引發認知功能障礙[2]。miR-146a 是神經系統疾病中一種重要的免疫調節因子，在固有免疫和神經免疫中均發揮著重要作用，可參與AD 疾病的神經炎癥過程[3]。有研究認為miR-23a 表達與炎癥反應的作用有密切聯系，但對于miR-23a 是否參與了AD 的炎癥機制尚無報告[4]。本研究分析miR-146a-5p、miR-23a-3p 與AD 認知功能障礙的相關性及對神經炎癥的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江中醫藥大學附屬杭州市中醫院2019 年1 月至2021年1 月收治的輕度認知障礙（MCI）與AD患者各50 例，設為MCI組和AD組。MCI組男31 例，女19 例；年齡64～82歲，平均（73.3± 9.8）歲；文化水平：小學15 例，初高中及中專26 例，大專及本科9 例。AD 組男28 例，女22 例；年齡60～81 歲，平均（71.9±9.3）歲；文化水平：小學16 例，初高中及中專26 例，大專及本科8 例。另納入同期到本院體檢的健康老年人群50 例設為對照組，其中男29例，女21 例；年齡63～80 歲，平均（71.6±9.3）歲；文化水平：小學17 例，初高中及中專25 例，大專及本科8 例。3 組性別、年齡、文化水平差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。本研究經本院倫理委員會審核通過。

1.2 入選標準 納入標準：年齡＞60歲；臨床資料完整，能夠配合完成各項檢查；未曾服用影響認知功能或激素類藥物；無內分泌系統疾病史；家屬簽署研究知情同意書。排除標準：存在既往精神疾病史，如抑郁癥、精神分裂癥等；具有顱腦損傷史；合并高血壓、糖尿病等慢性全身疾病史。

1.3 miR-146a-5p、miR-23a-3p 檢測抽取受試者入院后靜脈血3～4 ml，于4 ℃下12 000 r/min 離心5 min，吸取上清液分裝至EP 管中，－80℃凍存。取出凍存樣本室溫下自然解凍，取200l血漿樣本至另一個新EP 管中，加入900l裂解液MZA震蕩混勻30 s，室溫下放置5 min。加入200l 氯仿震蕩15s，室溫下放置5 min。EP 管于4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液置于新EP 管中，加入2 倍乙醇混勻，棄上清，室溫下靜置2 min，12 000 r/min 離心30 s，加入500l乙醇的蛋白液MRD，室溫下靜置2 min，12 000 r/min 離心30 s，棄上清，在加入500l乙醇的漂洗液RW，室溫下靜置2min，12 000 r/min 離心30 s，棄上清。處理后室溫下12 000 r/min 離心2 min，棄上清，通風揮發乙醇。用新的離心管滴入30l RNase-Free ddH2O，室溫靜置2 min，12 000 r/min 離心2 min，獲得洗脫緩沖液。獲取洗脫緩沖液后重復上一步驟獲取緩沖液RNA。應用紫外分光光度計NanoDrop 2000 測定RNA 純度。混勻后取適量管壁液體置于聚合酶鏈式反應（PCR）管中，加入反應液（2×miRNA RT Reaction Buffer 10l、Total RNA 8l、miRNA RT Enzyme Mix 2l）混勻，1 500 r/min 離心。應用ABI 的TaqMan Micro-RNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，獲得cDNA。反應維度及時間為42 ℃60 min，95 ℃3 min。在PCR 板置于冰上進行PCR 反應，反應液配制：2×miRcute Plus miRNA 10l、ddH2O 5.2l、50×ROX Reference Dye 2l、miRNA 第 一 鏈cDNA 2l、Reverse Primer（10mol/L）0.4l、Forward Primer 0.4l。應用ABI公司的Step one plus PCR System 熒光定量儀器進行PCR 反應，反應條件：95 ℃15 min 1 個循環；94 ℃20 s、64 ℃30 s、72 ℃34 s 5 個循環；94 ℃20 s、60 ℃34 s 45 個循環。完成后進行熒光數據采集。表達量計算：F=2－△△Ct。miR-146a-5p 引物 序 列 5’-TGCGCTGAGAACTGAATTCCAT-3’；miR-23a-3p 引物序列5’-CCTACATCGCACCGGAGTCTG-3’；以U6 為內參，引物序列：5’-GGGCAGGAAGAGGGCCTAT-3’[5-6]。引物購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 觀察指標（1）認知功能：采用簡易精神狀態評價量表（MMSE）[7]和改良版蒙特利爾認知評估量表（MoCA）[8]評估受試者認知功能。MMSE 量表包含5個部分，滿分30 分，≥25 分為認知正常，21～24 分為輕度認知障礙，18～20 分為中度認知障礙，≤17 分為重度認知障礙。MoCA 量表包含命名能力、注意力與計算力、語言功能、定向力、抽象思維能力、延遲回憶、空間功能與執行能力。滿分30 分，受教育年限＜12 年另+1 分，＜26 分即定義為認知功能損害，分數越低，認知功能損害越嚴重。（2）炎癥因子：抽取受試者入院后靜脈血3～4 ml，3 000 r/min 離心處理5 min，分離血清于試管中，－20℃凍存待檢。采用ELISA法檢測C-反應蛋白（CRP）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-）水平。（3）miR-146a-5p、miR-23a-3p 表達。（4）分析MMSE、MoCA 評分與miR-146a-5p、miR-23a-3p 表達的相關性。

1.5 統計方法 采用SPSS 23.0 統計軟件進行處理，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料用率（%）表示，采用2檢驗。相關性采用雙變量Pearson直線相關分析。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 認知功能 3 組MMSE評分、MoCA評分差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中AD 組＜MCI 組＜對照組（均P ＜0.05），3 組miR-146a-5p 和miR-23a-3p表達量差異均有統計學意義（均P ＜0.05），miR-146a-5p 表達量：AD 組＜MCI 組＜對照組，miR-23a-3p 表達量：AD組＞MCI組＞對照組（均P＜0.05）。見表1。

表1 3 組認知功能、miR-146a-5p、miR-23a-3p 比較

表2 3 組炎癥因子水平比較

2.3 MMSE、MoCA 評分與miR-146a-5p、miR-23a-3p 相關性 MMSE、MoCA評分與miR-146a-5p表達量呈正相關（r=6.258、6.640，均P＜0.05），與miR-23a-3p表達量呈負相關（r=－6.027、－5.874，均P ＜0.05）。

3 討論

研究發現，小膠質細胞活化與神經炎性反應在AD的發生發展中發揮著重要作用[9]。正常情況下，小膠質細胞在腦內處于靜息狀態，在受到刺激后，小膠質細胞迅速活化，可產生IL-1、IL-6、TNF-等一系列的炎癥因子，引發中樞神經系統炎癥級聯反應。郭敏等[10]研究指出腦內促炎因子增多時，可通過激活不同細胞的信號轉導通路、長時程增強效應、干擾突觸可塑性等機制參與認知功能損害。亢濤[11]研究指出AD 患者體內存在大量的炎癥因子表達。本研究顯示，AD組CRP、IL-1、IL-6、TNF-水平高于MCI 組和對照組，這說明炎癥反應參與了AD 的發生發展。

miRNA在神經系統中大量表達，具有特異性、區域性、時效性等特點，對神經元分化、腦組織的發育及高級神經功能具有重要的調節作用[12]。本研究顯示，AD 組miR-146a-5p 表達量低于MCI 組和對照組，miR-23a-3p 表達量高于MCI組和對照組，這說明 miR-146a-5p、miR-23a-3p 可能參與了AD患者的認知損害機制。經相關性分析顯示，MMSE、MoCA 評分與miR-146a-5p 表達量呈正相關，與miR-23a-3p 表達量呈負相關，進一步明確以上兩種基因參與認知功能損害的可能。

在神經系統疾病中，miR-146a 被認為是重要的神經免疫調節因子，炎癥因子作為免疫細胞之間的化學信使，能夠通過神經內分泌激素代謝和修飾神經遞質，從而影響神經發育和行為變化。陳芳榮等[13]研究指出，miR-146a-5p可通過對TRAF6 基因表達的抑制作用抑制炎癥反應。研究認為miR-146a-5p 作為一種調節細胞因子受體信號通路和Toll樣受體（TLR）信號通路的內源性調節因子，可通過級聯信號的放大作用抑制炎癥因子的表達，進一步誘導免疫及抑制炎癥反應。此外，在炎癥反應中，miR-23a的表達下調，可通過上調其靶基因從而抑制NF-xB 的過度活化，防止IL-1、IL-6、TNF-等促炎因子的過度表達進一步對神經造成損害。趙永杰[14]研究指出，miR-23a可能通過靶向NF-kB信號通路抑制基因發揮作用。這也是從miRNA的角度更明確地解釋了機體在免疫應答中存在一種負反饋調節機制[15]。由此可知，膠質細胞與神經炎癥級聯反應密切關聯，因此研究分析miR-23a-3p 與NFkB 信號通路發揮炎癥反應可影響中樞神經中膠質細胞的增生及突觸重建，從而損害AD 患者的認知功能。