SMAD4 在KRAS、BRAF 基因突變結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

張琳，陳祥義，楊宏杰，李鑫

結(jié)直腸癌（CRC）由于其高發(fā)病率和死亡率，已成為一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題[1]。最新數(shù)據(jù)顯示，男性和女性的CRC新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)均處在第3位[2]，嚴(yán)重危害人類健康。與其他惡性腫瘤相比，CRC 具有更高的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和更高的腫瘤突變負(fù)荷[3]，其發(fā)生發(fā)展是多因素參與作用的過程。

KRAS 和BRAF 編碼屬于RASRAF-MEK-ERK 信號(hào)通路的下游蛋白，該信號(hào)通路的過度激活在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，KRAS和BRAF突變導(dǎo)致該通路的持續(xù)激活并加速CRC 的進(jìn)展[4]。目前臨床研究證實(shí)，存在RAS、BRAF 突變的CRC患者不能從EGFR靶點(diǎn)的靶向治療中受益，但是針對(duì)KRAS、BRAF 基因的靶向治療比較困難，主要是由于信號(hào)通路之間的交聯(lián)、下游效應(yīng)因子的激活以及反饋環(huán)激活等多種因素使得臨床獲益不理想，因此尋找分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)極具迫切性和必要性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年1 月至2020 年12 月于嘉興學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的CRC標(biāo)本185 例，其中男122 例，女63 例；年齡為28～92 歲，平均（65.9±11.2）歲。所有標(biāo)本均常規(guī)行中性甲醛固定、石蠟包埋、切片及HE 染色，由病理醫(yī)師復(fù)閱切片明確診斷，并確定有足夠的腫瘤細(xì)胞再進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。本研究獲得嘉興學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（LS2021-XJS-132）。

1.2 主要試劑 核酸提取試劑盒（型號(hào)：FFRE DNA）、人類KRAS 基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）、人類BRAF基因V600E 突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）均購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，SMAD4 單克隆抗體（B-8，sc-7966）購(gòu)自Santa Cruz公司，免疫組織化學(xué)二抗顯示系統(tǒng)Real EnVision K5007購(gòu)自DAKO 公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 顯微鏡下觀察HE切片，選取腫瘤細(xì)胞比例達(dá)到20%以上的區(qū)域，盡量避開非腫瘤區(qū)、壞死出血區(qū)等。將石蠟包埋CRC 組織切成5 m 厚的切片，使用刀片刮取與標(biāo)記區(qū)域相對(duì)應(yīng)的組織，并轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的EP 管中，然后按照廈門艾德生物科技有限公司的核酸提取試劑說明書進(jìn)行操作。用Nanodrop2000 紫外可見分光光度計(jì)對(duì)DNA含量進(jìn)行定量，DNA 濃度大于2 ng/ l，OD260/OD280 介于1.8～2.0 之間。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 采用擴(kuò)增阻滯突變分析系統(tǒng)（ARMS）法檢測(cè)KRAS基因突變和BRAF 基因第15 外顯子V600E 熱點(diǎn)突變。按照廈門艾德生物科技有限公司的基因突變檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，在PCR 反應(yīng)中設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，共同進(jìn)行檢測(cè)和分析。PCR 擴(kuò)增過程：第一階段95℃5min，1個(gè)循環(huán)；第二階段95℃25s，64℃20s，72℃20s，15個(gè)循環(huán)；第三階段93℃25s，60℃35s，72℃20s，31 個(gè)循環(huán)。第三階段60℃時(shí)收集FAM 和HEX 信號(hào)。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色 組織切片65℃烤片2 h，常規(guī)脫蠟脫水，用EDTA修復(fù)液（pH9.0）在95℃～100℃水煮下進(jìn)行抗原修復(fù)20 min，3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，滴加一抗SMAD4（1∶400），用PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，室溫孵育1h，二抗顯示依據(jù)Real EnVisionK5007 試劑盒操作，二抗室溫孵育20 min，以1∶100 配制DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，然后蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、透明、封片。

1.3.4 免疫組化結(jié)果判定 由2 位高級(jí)職稱病理科醫(yī)師在雙盲條件下，采用半定量方法評(píng)估SMAD4 染色強(qiáng)度：如非腫瘤黏膜中的強(qiáng)表達(dá)（強(qiáng)）；表達(dá)減少（弱），強(qiáng)度低于正常黏膜；沒有染色（缺失）。腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的SMAD4 表達(dá)喪失的百分比被單獨(dú)評(píng)分，≥5%的腫瘤細(xì)胞沒有SMAD4 表達(dá)的病例被歸類為SMAD4 表達(dá)缺失。＞95%強(qiáng)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的病例被歸類為強(qiáng)SMAD4 表達(dá)，而其他病例被歸類為弱SMAD4 表達(dá)。如果免疫染色強(qiáng)度正常，則腫瘤被歸類為具有完整SMAD4 表達(dá)（SMAD4陽(yáng)性）；如果免疫染色強(qiáng)度弱或不存在，腫瘤被歸類為具有低SMAD4 表達(dá)（SMAD4 陰性）[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS、BRAF 基因突變情況 82例檢測(cè)到KRAS 基因突變，突變率為44.3%（82/185），突變主要位于第2 號(hào)外顯子，突變率為41.1%（76/185），其中以第2 號(hào)外顯子的第12 和13 密碼子的突變最為多見。9 例檢測(cè)到BRAF 基因突變，突變率為4.9%（9/185），KRAS 基因與BRAF 基因無(wú)共同突變。

2.2 SMAD4 在CRC 中的表達(dá)情況SMAD4 的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。免疫組化檢測(cè)到63 例SMAD4（34.1%）表達(dá)正常（SMAD4 陽(yáng)性），而122 例SMAD4（65.9%）表達(dá)微弱或缺失（SMAD4 陰性）。兩位病理醫(yī)師之間判讀的一致性為0.880.75，95% CI ：0.59～0.78）。見封三彩圖3。

圖3 SMAD4 在結(jié)直腸癌組織免疫組化分析中的表達(dá)（蘇木素，×20）

2.3 SMAD4 的表達(dá)與CRC 患者臨床病理特征的關(guān)系 SMAD4 的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤的分化程度以及BRAF狀態(tài)無(wú)關(guān)（均P＞0.05），與腫瘤位置、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及KRAS狀態(tài)顯著相關(guān)（均P ＜0.05）。見表1。

表1 SMAD4 表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性 例（%）

3 討論

CRC 是一種異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及一系列調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成的遺傳和表觀遺傳修飾[10]，一些致癌基因和抑癌基因，如TP53、APC、KRAS、NRAS、PIK3CA 和SMAD4 等，都參與了它的發(fā)展[11-13]。RAS 和BRAF是位于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)級(jí)聯(lián)下游的兩個(gè)原癌基因，它們的突變導(dǎo)致EGFR通路的組成型激活和結(jié)直腸腫瘤發(fā)生。臨床上只有RAS 和RAF 基因野生型患者才對(duì)抗EGFR單抗藥物治療有效，而突變型無(wú)效[14]。因此尋找分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)變得極為迫切。

SMAD4 是位于染色體18q21 上的抑癌基因，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-的下游效應(yīng)分子，被跨膜絲氨酸-蘇氨酸受體激酶磷酸化和激活，在TGF-通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物中作為共同介質(zhì)發(fā)揮重要作用，包括抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、細(xì)胞凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等。Mei等[15]認(rèn)為SMAD4 突變可能是基于西妥昔單抗的治療預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物，這需要在更大的患者隊(duì)列中進(jìn)一步驗(yàn)證。Lin 等[16]發(fā)現(xiàn)沉默SMAD4 通過促進(jìn)EMT 降低CRC細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的敏感性，而Smad4 的高表達(dá)可能在臨床上有益于基于西妥昔單抗的治療。這些發(fā)現(xiàn)表明SMAD4 致病變異在腫瘤進(jìn)展和靶向治療CRC 患者中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Safina 等[17]發(fā)現(xiàn)TGF-誘導(dǎo)的EMT不足以獲得侵襲潛力，而激活的RAS會(huì)改變反應(yīng)，賦予致瘤和侵襲潛力。因此，Ras-Raf-MAPK和TGF-/Smad級(jí)聯(lián)之間的協(xié)同作用是獲得癌癥侵襲性表型的必要條件。

本研究檢測(cè)了185 例CRC 患者石蠟標(biāo)本中KRAS、BRAF 基因突變情況，結(jié)果顯示KRAS 基因突變率為44.3%，第2 號(hào)外顯子突變率為41.2%，以第12和13 密碼子的突變最為多見，BRAF基因突變率為4.9%。KRAS、BRAF 突變?cè)贑RC 中是相互排斥的[18]，伴隨KRAS和 BRAF 突變的 CRC 極為罕見（0.001%），通常與更晚期的分期相關(guān)[19]，以上這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符[20]。接下來筆者分析了SMAD4 在CRC 中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示63 例（34.1%）SMAD4表達(dá)正常（SMAD4 陽(yáng)性），而122 例（65.9%）SMAD4 表達(dá)微弱或缺失（SMAD4 陰性）；同時(shí)筆者分析了SMAD4 與CRC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示具有更高的病理TNM 分期、腫瘤發(fā)生在結(jié)腸、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并且存在并發(fā)KRAS突變的患者SMAD4 表達(dá)越低，提示SMAD4 低表達(dá)或喪失與結(jié)直腸癌預(yù)后不良有關(guān)，也就是說導(dǎo)致蛋白表達(dá)低或缺失的SMAD4 突變與不良預(yù)后有關(guān)。這與 Fang 等[21]發(fā)現(xiàn)SMAD4 突變與OS、PFS/RFS 和臨床病理參數(shù)包括腫瘤部位、疾病分期、RAS狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和黏液分化相關(guān)的研究基本一致。但SMAD4 基因?qū)RAF 狀態(tài)的影響仍有待進(jìn)一步闡明。

由于SMAD4 與KRAS突變密切相關(guān)，它們的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。發(fā)生該作用的可能機(jī)制為：RAS 的表達(dá)上調(diào)磷酸酪氨酸激酶受體ERBB1（EGFR）和ERBB2（HER2）的表達(dá)并誘導(dǎo)侵襲性表型。Smad4 依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)這些受體的表達(dá)并抑制Ras 誘導(dǎo)的EGFR 和ERBB2 上調(diào)，從而發(fā)揮抗增殖作用。K RAS突變和SMAD4 信號(hào)的喪失協(xié)同上調(diào)EGFR 和ERBB2 的異常表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展和原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[22-23]。

綜上所述，SMAD4 對(duì)于研究CRC的發(fā)生、發(fā)展以及臨床預(yù)后判斷和治療均有重要意義。尤其是在 Ras-Raf-MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，將是下一步研究的重點(diǎn)。對(duì)于CRC 的個(gè)體化治療，SMAD4 作為驅(qū)動(dòng)突變，可能成為CRC 精準(zhǔn)醫(yī)療的新靶點(diǎn)。