Omi/HtrA2 抑制劑對蛛網膜下腔出血大鼠早期腦損傷的影響

程振宇，申屠華松，陳亦華，何忠平，俞北偉，王瑞權，傅斌

自發性蛛網膜下腔出血（SAH）可直接破壞腦組織，誘發劇烈的炎癥反應；同時破壞血腦屏障通透性，加重腦水腫。各種因素聚集造成神經細胞凋亡，誘發SAH 后的早期腦損傷[1-2]。Omi/HtrA2 是一種參與細胞凋亡的線粒體絲氨酸蛋白酶，而UCF-101 是Omi/HtrA2 特異性抑制劑[3]。動物實驗顯示，UCF-101 可顯著抑制腦缺血神經細胞凋亡[4]，改善外傷性脊髓損傷[5]，也可明顯降低膿毒癥性腦病腦炎癥反應和神經細胞凋亡及改善血腦屏障通透性[6-8]。本研究觀察UCF-101 腹腔注射對SAH 大鼠腦組織炎癥反應、腦水腫、血腦屏障通透性、神經細胞凋亡及相關蛋白表達的影響，旨在揭示Omi/HtrA2抑制劑對大鼠SAH后早期腦損傷的保護作用并探討其作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 健康Wistar 大鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），雄性，清潔級，體質量250～300 g；UCF-101（規格：5 mg/支，德國Calbiochem公司）；ApoAlert細胞凋亡檢測試劑盒（規格：100T/盒，美國Biosciences Clontech 公司）；白介素-1（IL-1）、IL-6 和 腫瘤壞死因子-（TNF-）酶聯免疫分析試劑盒（規格：96孔/kit，武漢艾美捷科技有限公司）；酶免疫分析儀（型號：iMark，美國Biorad 公司）；脫色搖床（型號：TY-80B，常州澳華儀器有限公司）；轉印槽（型號：Trans-Blot，美國Biorad 公司）；電泳儀（型號：DYCP-31C，北京六一生物科技有限公司）；小型垂直電泳槽（型號：164-8001，美國Biorad 公司）；生物倒置顯微鏡（型號：IX-71，中國奧林巴斯有限公司）。

1.2 動物模型制備 本研究經醫院倫理委員會審核，按照隨機數字表法將120只大鼠分成 Sham 組、SAH 組和UCF-101 組，每組40 只。根據指標測定的需要每組大鼠又被分成4 個亞組，各10 只大鼠，分別用于蛋白表達、細胞凋亡、腦水腫和血腦屏障通透性測定。采用Roux 等建立的枕大池二次注血法制作SAH 大鼠模型，Sham 組大鼠注入等量0.9%氯化鈉注射液。在手術操作前0.5 h，UCF-101 組大鼠腹腔注射UCF-101（劑量：3.0mol/kg），其余兩組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（劑量：10 ml/kg）。在24 h 后，處死大鼠進行指標測定。

1.3 Western-blotting 檢測 大鼠腦組織經細胞裂解、離心及蛋白濃度測定后，經凝膠電泳、電轉移和室溫封閉，加入兔抗大鼠 AQP-9、MMP-9、Occludin、Claudin-5、ZO-1、TIMP-1 和GAPDH 單克隆抗體孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗室溫搖床孵育，洗膜，化學發光試劑作用，X 光膠片曝光、沖洗并掃描。采用quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以GAPDH水平為內對照，比較相對灰度值。

1.4 細胞凋亡檢測 將大鼠腦組織進行4%多聚甲醛固定24 h后，脫水、透明、浸蠟進行包埋。4 m 厚度切片，60 ℃烤片3 h，切片脫蠟。根據ApoAlert TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，最后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像，計算凋亡神經細胞比例。

1.5 酶聯免疫吸附法測定 取腦組織標本研磨后置于離心管中，用高速勻漿器在沐浴中進行勻漿，以20 000 r/min 離心10 min，提取上清液按照試劑盒說明書操作，采用酶聯免疫吸附試驗檢測IL-1、IL-6 和TNF-濃度。

1.6 腦組織含水量測定 在10%水合氯醛麻醉下，大鼠斷頸處死，迅速取腦稱重，在80℃條件下的恒溫箱中烘烤48h后再次稱重兩次，兩次測定值之差＜0.2mg，采用公式計算腦水腫指數：腦水腫指數=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.7 血腦屏障滲透性測定 采用測定腦組織中伊文氏藍含量來確定大鼠血腦屏障的滲透性。首先建立伊文氏藍標準回歸曲線，然后經股靜脈注射伊文氏藍，處死大鼠，根據標準向左心室灌注0.9%氯化鈉注射液，切取顳底組織并稱重。腦組織與50%三氯乙酸溶液混勻后離心，取上清液，應用紫外分光光度儀進行比色，根據標準曲線計算出伊文氏藍含量，結果以g/g 腦組織表示。

1.8 統計方法 采用SPSS 19.0 統計軟件，數據以均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織炎癥因子表達SAH 組、UCF-101 組大鼠腦組織IL-1、IL-6 和TNF-表達水平高于Sham組（均P ＜0.05），且SAH 組各指標均高于UCF-101 組（均P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腦組織IL-1、IL-6 和TNF-表達水平 pg/mg

表1 各組大鼠腦組織IL-1、IL-6 和TNF-表達水平 pg/mg

2.2 各組大鼠血腦屏障通透性和內皮細胞緊密連接蛋白表達 SAH 組、UCF-101 組大鼠腦組織 occludin、claudin-5 和ZO-1 蛋白表達均低于Sham組（均P ＜0.05），且SAH組上述指標均低于UCF-101 組（均P ＜0.05）；SAH組、UCF-101 組血腦屏障通透性均高于Sham 組（均P ＜0.05），且SAH 組高于UCF-101 組（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血腦屏障通透性和內皮細胞緊密連接蛋白表達

2.3 各組大鼠腦水腫指數和基質蛋白表達 SAH 組、UCF-101 組大鼠腦組織TIMP-1 蛋白表達均低于Sham 組（均P＜0.05），SAH 組低于UCF-101 組（P ＜0.05）。SAH 組、UCF-101 組大鼠腦水腫指數、腦組織MMP-9 和AQP-9 蛋白表達均高于Sham組（均P＜0.05），且SAH組上述各指標均高于UCF-101 組（均P＜0.05）。見表3。

表3 各組腦水腫指數和基質蛋白表達

2.4 各組大鼠腦組織神經細胞凋亡情況 Sham 組、SAH 組和UCF-101 組大鼠腦組織凋亡神經細胞比例依次是（5.92±1.00）%、（26.68±4.92）% 和（15.85±2.24）%（F=219.45，P ＜0.001）。SAH組、UCF-101 組大鼠腦組織凋亡神經細胞比例高于Sham組（均P＜0.05），且SAH 組高于UCF-101 組（均P ＜0.05）。見封三彩圖2。

圖2 各組大鼠腦組織神經細胞凋亡情況

3 討論

SAH 后早期腦損傷的病理生理機制相當復雜，涉及炎癥反應、細胞凋亡、血腦屏障的破壞及腦水腫的形成等。這一系列過程由諸多蛋白參與和調節，從而維持一個相對平穩的狀態[9-11]。在急性腦損傷后，腦組織中的炎癥因子、內皮細胞緊密連接蛋白、水通道蛋白和基質蛋白（如IL-1、IL-6、TNF-、AQP-9、MMP-9、Occludin、Claudin-5、ZO-1 和TIMP-1 等）的表達水平均會發生不同水平的改變，IL-1、IL-6、TNF-、AQP-9和MMP-9 蛋白表達水平上調，Occludin、Claudin-5、ZO-1 和TIMP-1 蛋白表達水平下降。這些蛋白表達水平的改變，造成腦組織穩態的破壞，出現了神經細胞凋亡和腦炎癥反應的加劇，以及血腦屏障的破壞及腦水腫的形成[1-2]。本研究顯示，SAH大鼠神經細胞凋亡、腦水腫和血腦屏障通透性加重的同時，也伴有上述蛋白表達水平的改變。因此，通過檢測上述蛋白在腦組織中的表達水平也一定程度上反映了SAH 大鼠腦損傷的程度。

Omi/HtrA2 是一種線粒體絲氨酸蛋白酶，可以增強含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶活性，從而參與細胞凋亡[3]。UCF-101 是Omi/HtrA2 特異性抑制劑，可以抑制急性肺炎大鼠肺炎癥反應和細胞凋亡[12]，也可以抑制帕金森氏病大鼠的內質網氧化應激反應[13]，同時對腦缺血大鼠的神經細胞凋亡的抑制作用表現明顯[4]，且可降低膿毒癥腦部大鼠炎癥反應、神經細胞凋亡和血腦屏障通透性[6-8]。因此，Omi/HtrA2 抑制劑對SAH 大鼠腦損傷可能具有保護作用。研究提示，采用Omi/HtrA2 抑制劑UCF-101 腹腔注射治療實驗性缺血性腦損傷、外傷性脊髓損傷和膿毒癥性腦病具有一定效果[4-8]。關于UCF-101 腹腔注射的劑量沒有統一的標準，用于腦缺血和膿毒血癥腦病大鼠腹腔注射的UCF-101劑量分別是1.5mol/kg[4]和10mol/kg[6]。本研究采用的UCF-101腹腔注射的劑量是3mol/kg，結果顯示，使用UCF-101 腹腔注射對SAH大鼠進行治療可以顯著逆轉SAH 造成的大鼠腦組織 IL-1、IL-6、TNF-、AQP-9、MMP-9、Occludin、Claudin-5、ZO-1 和TIMP-1 蛋白表達水平的變化，降低神經細胞凋亡，改善血腦屏障通透性和減輕腦水腫。因此，UCF-101 對SAH 大鼠腦損傷可能具有顯著保護作用，其機制可能與其修復血腦屏障、減輕腦水腫、抑制促炎因子釋放和降低神經細胞凋亡有關。

綜上所述，本研究初步揭示了Omi/HtrA2 抑制劑UCF-101 對SAH 腦損傷的保護作用及機制，為下一步繼續研究UCF-101 做為SAH 腦損傷治療新藥提供一定的理論依據。