蒙特卡洛法對校準曲線法測定總膽紅素濃度的不確定度評定

孟舒婷， 周衛平， 戴繪芬， 董德平， 董業峰， 葛仁美， 王惠民

（1.南通大學附屬海安醫院檢驗科，江蘇 南通 226600；2.南通市通州區人民醫院檢驗科，江蘇 通州 226300；3.海安市中醫院檢驗科，江蘇 南通 226600；4.南通大學附屬醫院檢驗科，江蘇 南通 226601）

血清總膽紅素作為一項重要的臨床生化指標，其檢測值的準確性對臨床診斷肝臟疾病或膽道梗阻有重要意義[1]。基質效應、互換性和“單點濃度”正確度評價的局限性，易造成濕化學法總膽紅素檢測結果偏高，導致結果偏移。近年來，國內外高度關注檢驗結果的一致性，檢驗結果一致性的關鍵是溯源，不確定度則是保證溯源可靠性的重要方法。總膽紅素屬于化學定義明確的小分子化合物，按ISO 17511文件[2]要求，總膽紅素測量結果可通過參考方法或標準物質直接或間接溯源至國際單位制（international system of units，SI）單位。常規檢測結果可溯源至參考方法或參考物質，才能保證檢驗結果的準確性，實現同級別不同實驗室間檢測結果的互認[3-4]。

目前，國際上對不確定度評定方法的分類尚無公認標準，按照對輸入量分布類型的處理方式可分為3種：以測量不確定度表達指南（the Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，GUM）為框架的不確定度評定方法（GUM uncertainty framework，GUF）、蒙特卡洛法（Monte Carlo method，MCM）和自助法（bootstrap method，BM）。用于評定測量不確定度采用的MCM是一種通過重復采樣實現分布傳播的數值方法。與GUF利用線性化模型傳播不確定度的解析方法不同，MCM通過對輸入量Xi的概率密度函數（probability density function，PDF）離散采樣，由測量模型傳播輸入量的分布，計算獲得輸出量Y的PDF的離散采樣值，進而由輸出量的離散分布數值直接獲取輸出量的最佳估計值、標準不確定度和包含區間[5]。近年來，已有報道將MCM用于參考實驗室測定酶催化活性的不確定度評定[6-7]，但對合理評定多水平標準液構建的標準曲線所得到的測量結果及其不確定度仍在探索中。本研究嘗試通過建立對應的標準曲線的數學模型，結合人工智能軟件，應用MCM評定血清總膽紅素濃度的測量不確定度，為合理評定類似測量程序的不確定度提供新思路。

1 材料和方法

1.1 儀器

日本日立公司U-3310紫外/可見分光光度計，配備半導體控溫、點溫計裝置和反應分析軟件；美國Fluke公司Hart Scientific 1521型電子溫度計（精度0.001 ℃）；意大利Hanna公司H198183型pH計（精度0.002）；德國Sartorius 公司BT25S電子天平（精度0.01 mg）；美國Millipore公司Direct-Q 3UV純水儀；德國Eppendorf公司Reference移液器。分光光度計、天平、pH計、溫度計和移液器均由南通市計量局進行檢定，分光光度計每天使用前自檢，天平、pH計每次使用前自校。

1.2 試劑

二甲亞砜（批號BCBN0845V）、碳酸鈉（批號MKAA0325V）、對氨基苯磺酸（批號BCBL5743V）、亞硝酸鈉（批號SCBJ4432V）、安息香酸鈉（批號SLHB7401V）、醋酸鈉（批號BCBN2082V），三羥甲基氨基甲烷[2-Amino-2-（hydroxymethyl）-1，3-propanediol Tris；批號SLBH9329V]，牛血清白蛋白（批號066K0708），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA；批號WXBB34432），四水酒石酸鉀鈉（批號SLBC8354V）和氫氧化鈉（批號SZBE0140V）購自美國Sigma公司；咖啡因（批號140703A）購自北京阿匹斯生物技術有限公司；膽紅素標準物質（14061603）購自北京恒元啟天化工技術研究院。

1.3 樣品濃度測定

將國際臨床化學和檢驗醫學聯合會（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）2014年參考實驗室外部質量評價計劃國際比對樣本A、樣本B 2個濃度水平樣品用稱重法復溶至5 mL。記錄室溫下蒸餾水的質量及水溫，查《1990水溫國際溫標純水密度表》，換算實際復溶的體積。嚴格按照國際檢驗醫學溯源聯合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）列表推薦的總膽紅素參考測量程序[8]（Doumas法）進行樣品濃度的測定，重復10次，計算樣本的濃度水平。

1.4 方法

基于MCM，利用MATLAB 2012a軟件實現對總膽紅素測量結果不確定度的評定

1.4.1 建模 建立評定總膽紅素不確定度的5個數學模型。標準曲線斜率的數學模型為：

式中b為標準曲線的斜率，x為各標準管的濃度，y為各標準管的對應的吸光度值（A），a為標準曲線的截距，n為標準管的數量。各輸入量均具有相應的概率密度分布。

1.4.2 MCM評定總膽紅素測量結果的不確定度 （1）MCM輸入。①定義輸出量Y，即需測量的量（被測量）；②確定與Y相關的輸入量；③建立Y和X1…XN之間的數學模型；④利用可獲信息，為Xi設定PDF，如正態分布、矩形（均勻）分布等；⑤選擇MCM試驗樣本量M。（2）MCM傳播。①從輸入量Xi的PDF中抽取M個樣本值；②根據測量模型計算每個隨機抽取樣本的相應Y值。（3）MCM輸出。嚴格按照遞增次序將M個Y值進行排序，基于排序的模型值得到輸出量Y的PDF。（4）報告結果。①根據Y的PDF計算Y的估計值y及y的標準不確定度（u）；②根據Y的PDF計算給定包含概率p時對應Y的包含區間 [ylow，yhigh]。

2 結果

2.1 用于MCM模擬的試驗數據

2014年國際比對樣本總膽紅素A值和不同濃度標準液數據見表1、表2。

表1 2014年國際比對樣本A和樣本B總膽紅素A值和統計結果

表2 不同濃度標準液的統計數據

2.2 MATLAB軟件運行MCM程序及軟件模擬結果

2.2.1 MCM程序運行

在MATLAB軟件File菜單下輸入對應的function函數（圖1）。點擊綠色箭頭圖標運行，開始運算。為獲得95%置信概率下包含區間，將PDF采樣次數M設置為106次。MATLAB軟件對各輸入量進行隨機采樣，“random”表示隨機采樣。對各個PDF進行106次采樣后，通過軟件求得輸出量不確定度。根據建立的5個數學模型編寫Matlab程序，計算標準曲線濃度均值及其不確定度、標準曲線吸光度均值及其不確定度、測量結果及其不確定度。

圖1 軟件中輸入function函數

2.2.2 MATLAB軟件模擬結果

（1）MATLAB軟件模擬生成的5組參數見圖2～圖7。

圖2 標準曲線斜率（b）頻數直方圖

圖3 標準曲線濃度均值（）頻數直方圖

圖4 標準曲線吸光度均值（ ）頻數直方圖

圖5 標準曲線截距（a）頻數直方圖

圖6 國際比對樣本A、樣本B濃度頻數直方圖

圖7 軟件命令窗口輸出運行數據

（2）MATLAB軟件模擬生成數據。參考實驗室條件下總膽紅素國際比對樣本A測定結果為：b=0.007 531 6，s=0.000 025 51；=87.284 4 mg/L，s=0.196 5；=0.657 917，s=0.000 365 4；a=0.000 525 16，s=0.002 699；= 39.368 8 mg/L，u=0.603 2；95%可信區間為38.188 0～40.553 5。樣本B測定結果為：b=0.007 531 6，s=0.000 025 51；= 87.284 4 mg/L，s=0.196 5；=0.657 917，s=0.000 365 4；a=0.000 525 16，s=0.002 699；=18.703 1 mg/L，u=0.296 4；95%可信區間為18.122 5～19.284 4。用自適應MCM[9]驗證GUF包含區間，結果顯示，2組絕對偏差dlow和dhigh值均>數值容差0.05，GUF法的結果未通過MCM驗證[10]。

3 討論

血清總膽紅素是評估肝功能的重要常規指標之一，對于患者病情的判斷、鑒別診斷有著重要的指導作用。總膽紅素測定是具備完整的參考系統的項目，理論上可溯源至SI單位，從而實現總膽紅素項目的量值溯源和標準化。考慮到血清總膽紅素測定過程中存在明顯基質效應，且在常規測量條件下無法做到絕對避光，含測量不確定度信息的總膽紅素標準物質的純品不可直接用于血清總膽紅素的校準[8]。ISO/TS 25680規定：對于無適宜標準物質/質控物的檢測指標，只能用方法學比對法進行評價[11]。因此，JCTLM列表推薦的參考方法（Doumas法）[12]成為總膽紅素參考測量系統解決臨床實驗室測量結果標準化問題的關鍵，而測量不確定度的評定則是亟需解決的問題。

血清總膽紅素參考測量程序采用校準曲線法，該方法通過對一系列已知含量的標準液進行最小二乘法回歸建模（partial least squares regression，PLS）繪制成校準曲線，根據測得的樣品信號值從校準曲線得出待測總膽紅素濃度[13]。該曲線并非通過所有測量點，而是無限接近所有點，需進行精密度檢驗，判斷檢驗擬合有無異常。曲線擬合過程中的斜率與截距會間接影響曲線擬合的準確性。本研究首次應用MCM對總膽紅素標準曲線中的各個濃度的概率密度函數及吸光度的概率密度函數構建測量模型，獲取了標準曲線的斜率和截距的概率分布，直觀計算測量結果的均數、標準差（不確定度）與相應概率下的分布區間。

MCM作為GUF的一種替代和補充方法[9]，具備以下實際應用優勢：（1）如數據呈偏正態分布，第二類錯誤的發生率必然升高，MCM無需考慮變量間的相互作用和輸出量分布類型（如模型非線性）等局限認識，且模擬過程不受輸入量分布類型及相關性影響，避免了傳統GUF中k值偏于保守，擴展不確定度可能偏大的情況；（2）結果表達中，在確定包含區間時，MCM無需考慮包含因子，以區間的形式代替擴展不確定度，測量結果的不確定度更直觀，更易理解；（3）MCM借助計算機模擬過程，對相關輸入量的分布進行處理，避免了傳統GUF的繁瑣計算，顯著提升了效率。基于MCM評定測量不確定度引入主觀因素少，對測量模型采用“海量”數據模擬，減少了第二類誤差，可獲得更真實的測量結果均數、標準差（不確定度）、一定概率下（95%）的分布區間，更為精準、適用范圍更廣。但MCM本質是基于隨機抽樣，因此每次輸出結果會有細微差異，但對比組之間的差異無統計學意義[14]。目前，MATLAB軟件在影像學3D建模、心腦血管血流動力學分析中的應用較多，但在醫學檢驗領域應用較少，將MATLAB軟件用于檢驗領域具有一定的前瞻性，對于多濃度校準曲線檢測有一定指導意義，可用于不同實驗室檢驗結果的互認。基于MCM原理，結合MATLAB軟件，本研究基于MCM對血清總膽紅素的不確定度進行了評定，運行結果與GUF結果比較，證明在經典方式不適用的情況下，MCM是優于GUF的不確定度評定方法。