浙江地區(qū)新建新型冠狀病毒核酸檢測實驗室質(zhì)量現(xiàn)狀分析

陳 倩， 單志明， 宋 超， 康鳳鳳， 金 靜， 酈衛(wèi)星

（浙江省臨床檢驗中心 浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014）

目前，核酸檢測仍是發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒感染者的關(guān)鍵技術(shù)手段，對于及時發(fā)現(xiàn)傳染源、降低疫情擴(kuò)散風(fēng)險、落實“早發(fā)現(xiàn)”原則具有重要意義。按照國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制《進(jìn)一步推進(jìn)新冠病毒核酸檢測能力建設(shè)工作方案》要求[1]，二級及以上綜合醫(yī)院、傳染病專科醫(yī)院、各級疾病預(yù)防控制中心均應(yīng)具備核酸檢測能力，并提供檢測服務(wù)。2020年1月以來，浙江省臨床檢驗中心驗收通過了230余家新型冠狀病毒核酸檢測實驗室，同時也培訓(xùn)了20 000余名新上崗聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）操作人員。為了有效評估新上崗PCR檢測人員的專業(yè)技術(shù)能力和實驗室檢測能力，我們用組隊模式隨機(jī)抽查了450名檢測人員，發(fā)現(xiàn)新持證人員各項成績均低于原有持證人員，且差異明顯[2]，但2020年1月后新建的新型冠狀病毒核酸檢測實驗室（簡稱新建實驗室）與2020年1月前取得資質(zhì)的實驗室（簡稱原有實驗室）的檢測能力與質(zhì)量差異還有待評估。新建實驗室通過驗收后至少試運(yùn)行了6個月，運(yùn)行期間檢測了一定數(shù)量的樣本，并累積了一定的工作經(jīng)驗，因此我們認(rèn)為對其展開調(diào)查的時機(jī)相對成熟。本研究基于現(xiàn)場督查不符合項分布和考核結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量現(xiàn)狀分析，比較新建實驗室與原有實驗室之間的質(zhì)量差異，尋找共性問題，以提升核酸檢測實驗室檢測能力。

1 材料和方法

1.1 督察對象

隨機(jī)抽選浙江地區(qū)179家開展新型冠狀病毒核酸檢測的實驗室，其中新建實驗室107家，原有實驗室72家。

1.2 督查人員

由浙江省臨床檢驗中心及專家委員所在單位的核酸檢測業(yè)務(wù)骨干組成15人督查組，所有人員督查前進(jìn)行培訓(xùn)，統(tǒng)一考核標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 督察依據(jù)

依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行第二版）》[3]、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》[4]、《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[5]、《新型冠狀病毒核酸快速檢測臨床規(guī)范化應(yīng)用專家共識》[6]中的要求制定督查標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 督察方案

（1）督查組成員攜帶考核樣本，分成不同路線同時到達(dá)某個地區(qū)，完成對該地區(qū)抽查實驗室的現(xiàn)場督查工作，并監(jiān)督實驗室上報定性結(jié)果與循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）。（2）定制2 000拷貝/mL假病毒顆粒質(zhì)控物（鄭州安圖公司，批號為300901100601，1.0 mL/支），要求實驗室用2種方案檢測：方案一為常規(guī)檢測，即將原始樣本（1 000拷貝/mL）和實驗所使用的病毒保存液混合稀釋成750拷貝/ mL，各檢測1次；方案二為快速檢測，即核酸提取、擴(kuò)增檢測均在同一封閉、便攜式儀器上完成，樣本上機(jī)至結(jié)果報告無需任何手工操作，且全流程時間不超過90 min；用實驗所使用的病毒保存液將質(zhì)控物稀釋成500拷貝/mL，重復(fù)檢測2次。（3）考核實驗室對質(zhì)控物測定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的符合度（質(zhì)控物樣本和稀釋樣本均要求檢出，有1種樣本未檢出即判定為假陰性結(jié)果），定性結(jié)果根據(jù)實驗室陰、陽性結(jié)果與預(yù)期結(jié)果是否符合，計算符合率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 現(xiàn)場督察不符合條款分布

107家新建實驗室共發(fā)現(xiàn)不符合條款638條，平均每家實驗室發(fā)生6條；72家原有實驗室共發(fā)現(xiàn)不符合條款171條，平均每家實驗室發(fā)生3條。原有實驗室與新建實驗室不符合項條款分布情況見表1。進(jìn)一步分析督查中原有實驗室與新建實驗室不符合項所占比例較高的“4.4室內(nèi)質(zhì)控”和“2.3性能驗證”內(nèi)的具體不符合項分布，以及新建實驗室不符合項所占比例較高的“4.2快速檢測”內(nèi)的具體不符合項分布，結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

圖1 室內(nèi)質(zhì)控條款內(nèi)具體不符合項分布

圖2 性能驗證條款內(nèi)具體不符合項分布

圖3 快速檢測條款內(nèi)具體不符合項分布

表1 原有實驗室與新建實驗室現(xiàn)場質(zhì)量督察不符合條款分布情況

2.2 質(zhì)控物考核結(jié)果

2.2.1 不同品牌試劑檢測結(jié)果符合率 根據(jù)實驗室使用的試劑盒說明書中的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)檢測假陰性結(jié)果均發(fā)生于新建實驗室。原倍樣本與稀釋樣本2個陽性結(jié)果符合情況見表2。

表2 不同品牌試劑盒結(jié)果符合情況

2.2.2 新建實驗室與原有實驗室常規(guī)檢測系統(tǒng)配套、非配套以及快速檢測結(jié)果符合率 根據(jù)實驗室是否使用試劑盒說明書推薦的核酸提取試劑、提取儀、擴(kuò)增儀分為配套與非配套2種情況，原有實驗室檢測系統(tǒng)配套性優(yōu)于新建實驗室，開展快速檢測方法在新建實驗室中所占比例較高；在常規(guī)檢測系統(tǒng)配套與非配套、快速檢測結(jié)果中，原有實驗室ORF1ab基因和N基因結(jié)果符合率均為100%，高于新建實驗室。見表3。

表3 不同檢測系統(tǒng)配套情況原有實驗室與新建實驗室考核結(jié)果比較

2.2.3 常規(guī)檢測Ct值結(jié)果分布 常規(guī)檢測N基因的Ct值均值低于ORF1ab基因；1 000拷貝/mL和750拷貝/mLCt值均值變化<0.5；超過85%的實驗室Ct值結(jié)果與Ct值均值相差<±3個周期，僅有1.13%～2.82%的實驗室Ct值與Ct值均值相差>±5個周期。見表4、圖4。

圖4 常規(guī)檢測實驗室單個靶標(biāo)Ct值范圍

表4 常規(guī)檢測Ct值結(jié)果分布

2.2.4 快速檢測Ct值結(jié)果分布 快速檢測同時有2個假陰性結(jié)果的情況均出現(xiàn)在新建實驗室。快速檢測2次檢測結(jié)果平均Ct值無明顯差異，見表5。

表5 不同品牌試劑盒快速檢測Ct值結(jié)果

3 討論

我國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[7]將實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測新型冠狀病毒陽性作為新型冠狀病毒肺炎的確診依據(jù)之一，而開展這項檢測無論是對實驗室硬件設(shè)施、操作人員資質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、生物安全管理等都有較高的要求，實地督查和外部質(zhì)量評估可幫助實驗室發(fā)現(xiàn)問題，及時整改，提高實驗室檢測質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，新建實驗室發(fā)生不符合條款平均值（6條）多于原有實驗室（3條），新建實驗室檢測系統(tǒng)配套性情況（25.23%）弱于原有實驗室（75.00%），常規(guī)檢測與快速檢測的假陰性結(jié)果均發(fā)生于新建實驗室。在常規(guī)檢測中，原有實驗室與新建實驗室不符合項均集中于室內(nèi)質(zhì)控與性能驗證這2個條款內(nèi)，是共性問題。

基于先前的室間質(zhì)評數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果是存在的潛在和不可避免的問題。本研究質(zhì)控物考核結(jié)果顯示，假陰性結(jié)果均發(fā)生在3家使用非配套檢測系統(tǒng)的新建實驗室，表現(xiàn)為ORF1ab基因單靶標(biāo)陰性，其中1家實驗室檢測系統(tǒng)雙靶標(biāo)陰性，2家實驗室快速檢測報告假陰性結(jié)果。結(jié)合督查結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)新建實驗室主要以二級醫(yī)院為主，二級醫(yī)院實驗室工作人員平均為13人，較難有分子檢測學(xué)歷背景，包括分子檢測實驗室負(fù)責(zé)人，本次考核與先前室間質(zhì)評最大的區(qū)別是督查專家隨機(jī)抽選人員進(jìn)行檢測，操作不熟練或操作失誤是造成假陰性結(jié)果的主要原因；另外，實驗室檢測系統(tǒng)的性能也同樣對檢測結(jié)果有重要影響，新建實驗室配套性與原有實驗室差異較大，且沒有能力獨(dú)立完成性能驗證，導(dǎo)致實驗室人員對在用非配套的檢測系統(tǒng)性能沒有及時了解與掌握，無法排除潛在的風(fēng)險。

本次考核結(jié)果提示，原有實驗室與新建實驗室均應(yīng)加強(qiáng)室內(nèi)質(zhì)控管理，尤其是對弱陽性室內(nèi)質(zhì)控Ct值進(jìn)行有效監(jiān)控。目前，實驗室所用第三方質(zhì)控物為均一假病毒顆粒物質(zhì)，Ct值具有一定可比性。將假病毒顆粒稀釋后制成濃度為檢出限1.5～3.0倍的弱陽性質(zhì)控物來進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，可以更好地反映基質(zhì)效應(yīng)，同時監(jiān)測核酸檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性[8]。有研究結(jié)果表明，繪制質(zhì)控圖能盡早發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增異常的實驗室批次或者設(shè)備的異常情況，避免漏檢與誤檢[9]。在督查中我們發(fā)現(xiàn)，有極小部分實驗室對每日多批次的弱陽性Ct值結(jié)果通過質(zhì)控圖趨勢監(jiān)控，小部分實驗室用記錄表抄寫監(jiān)測，大部分實驗室未進(jìn)行有效監(jiān)測。除弱陽性質(zhì)控外，3個陰性室內(nèi)質(zhì)控同樣重要，對于實驗室環(huán)境防污染和實驗過程是否正確具有重大意義，但僅有個別實驗室對3個陰性室內(nèi)質(zhì)控進(jìn)行隨機(jī)設(shè)置。

實驗室應(yīng)按預(yù)期用途評估性能參數(shù)，明確驗證方案，確保性能符合相關(guān)規(guī)定。本研究具體不符合項分布結(jié)果顯示，精密度方案驗證錯誤、性能驗證報告缺少必要信息和更換試劑耗材后未及時更新、未選擇適當(dāng)?shù)尿炞C樣本等問題均有不同比例發(fā)生，本次調(diào)查的實驗室選用的檢測試劑盒均基于實時熒光PCR法，其原理是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因的表達(dá)，因此PCR試劑盒并不是保證結(jié)果準(zhǔn)確的唯一決定因素，提取試劑盒、提取儀與擴(kuò)增儀的選用也會影響分析性能[10]。浙江省臨床檢驗中心前期在室間質(zhì)評成績不合格的實驗室倒查中也發(fā)現(xiàn)不合格實驗室存在不同品牌提取儀、擴(kuò)增儀及PCR試劑盒之間的隨機(jī)搭配使用的情況[11]，這會對檢測性能造成很大影響，建議新建實驗室在條件允許的情況下盡量選用配套檢測系統(tǒng)，如選用非配套系統(tǒng)，要做好一致性評價，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及一致性。MALECKI等[10]提出，實驗室不僅要立即和徹底地實施現(xiàn)有的試劑盒在當(dāng)前提取方法和PCR儀器的效果，且要確定實施的性能驗證方案，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

快速檢測因無需進(jìn)行反應(yīng)體系試劑配制，具有核酸快速釋放與擴(kuò)增一體化特點，與常規(guī)檢測相比，具有檢測速度快和設(shè)備便攜等優(yōu)點[11]。由于方法學(xué)的限制，快速檢測重復(fù)性與常規(guī)檢測存在一定差異[12]。本研究不符合項分析結(jié)果顯示，較為嚴(yán)重的問題集中于“室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價”，新建實驗室相對于原有實驗室質(zhì)控意識較為薄弱，質(zhì)量控制體系有待完善。

綜上所述，新建實驗室在室內(nèi)質(zhì)控、性能驗證、快速檢測三方面的質(zhì)量管理上仍存在缺陷與不足，建議加強(qiáng)質(zhì)量控制，同時強(qiáng)化人員培訓(xùn)，提高人員操作技能，增加室間質(zhì)評頻次，以最大程度避免假陰性結(jié)果。