分子對接結合熒光光譜法探究楊梅苷與胰蛋白酶相互作用機理

于 湛, 孫 璐,2, 谷笑雨, 劉珂帆, 劉麗艷, 王曉丹

(1. 沈陽師范大學 化學化工學院, 沈陽 110034;2. 北京師范大學 化學學院, 北京 100875; 3. 朝陽市第一中學, 遼寧 朝陽 122000)

0 引 言

胰蛋白酶(trypsin,Tryp)作為一種重要的蛋白酶,位于人及動物的腸道中[1]。Tryp除了具有消化與分解蛋白質的作用外,還可調控腫瘤細胞生長、分化與增殖[2],在生物、食品工業以及腫瘤研究等領域具有廣泛應用[3]。

楊梅苷(myricitrin,MYT)是楊梅素的一種重要糖苷化衍生物[4],其分子結構如圖1所示。MYT的天然來源豐富,主要分布在楊梅的果實、樹葉、藤茶以及龍眼葉等物質中,MYT具有較強的抗氧化作用,在人體內可有效清除自由基,因此作為藥物與保健食品具有良好的應用前景[5]。

圖1 楊梅苷的分子結構Fig.1 Molecular structure of MYT

本文研究了Tryp和MYT間的相互作用情況,旨在為了解MYT在體內的吸收、分布以及代謝等提供幫助,并為設計、開發基于MYT的新藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器:熒光光譜儀(Cary Eclipse,Varian,USA)、紫外-可見光譜儀(UH5300,Hitachi,Japan)、pH計(FE20K,Mettler Toledo,USA)、高精度磁力水浴裝置(自制)。

主要試劑:MYT(上海阿拉丁公司)、牛胰蛋白酶(Tryp)(美國Amresco公司)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)(美國Sigma-Aldrich公司)、NaCl, HCl, NaOH與無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)、實驗用水(超純水,18.2 MΩ·cm)。

1.2 溶液配制

配制質量濃度為5.0×10-4mol·L-1的MYT乙醇溶液和質量濃度為0.1 mol·L-1, pH值為8.4的Tris-HCl緩沖溶液備用(其中NaCl質量濃度為0.1 mol·L-1),配制1.0×10-3mol·L-1的Tryp儲液備用。

在7只5 mL的一次性離心管中分別準確移取200 μL的Tryp溶液以及適量的MYT儲液,并加入1 100 μL的Tris-HCl緩沖溶液,隨后加水定容至4.0 mL,使得每只離心管中MYT的質量濃度分別為0.0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5及1.50×10-5mol·L-1。將這些離心管經過渦旋混合20 s后恒溫水浴15 min,之后進行熒光測試。

1.3 熒光光譜儀參數

設置熒光光譜儀的λem=280 nm,λ(emslit)=λ(ex slit)=5 nm,掃描范圍為280～500 nm;設置同步熒光光譜波長差(Δλ)分別為15與60 nm,掃描范圍為200～500 nm。

1.4 分子模擬參數

在RCSB PDB數據庫得到Tryp的晶體結構(ID:2PTN),在PubChem網站獲得MYT的結構數據。通過AutoDockFR 1.2程序包[6]模擬Tryp與MYT的分子對接過程。將Tryp與MYT分子導入AutoGridFR后,docking box設置為box entire receptor,padding space設置為8.0 ?,grid point space設置為0.375 ?,隨后使用內置AutoSite 1.1程序進行主體對接口袋計算,nbRuns與maxEvals采用AutoDockFR的默認值,分別為50與2 500 000。

本文使用Desmond程序[7]進行分子動力學模擬。首先在一個10 ?×10 ?×10 ?的立方體箱子中導入得分最高的分子對接結果,再將立方體箱子中充滿TIP3P模型水,選擇NPT系綜,體系經過2 ns的預平衡后弛豫到指定的壓力與溫度,最后進行30 ns的分子動力學模擬。

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅

采用式(1)對熒光發射的強度進行校正[8]。

Fcorr=Fobs×e(Aex+Aem)/2

(1)

其中:Fobs與Fcorr為校正前后的熒光強度;Aex為激發波長下Tryp與MYT混合溶液的紫外-可見吸收強度;Aem為發射波長下Tryp與MYT混合溶液的紫外-可見吸收強度。

經過校正,在水浴溫度為17 ℃,pH值為8.4的條件下,含有不同質量濃度MYT的5×10-5mol·L-1Tryp溶液的熒光發射光譜如圖2(a)所示。由圖2(a)可見,Tryp在300～450 nm存在較為明顯的熒光發射,最大發射波長位于335 nm處,隨著MYT質量濃度的升高,Tryp熒光發射曲線的形狀并未改變,但發射強度有所下降,表明MYT對Tryp產生明顯的猝滅現象。

圖2 (a) MYT在不同質量濃度時Tryp的熒光發射曲線(Tryp質量濃度為5×10-5mol·L-1,MYT質量濃度從1→7分別為0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5, 1.5×10-5mol·L-1); (b) MYT與Tryp相互作用的Stern-Volmer圖Fig.2 (a) Fluorescence curves of Tryp with the existence of various concentrations of MYT(the concentration of Tryp is 5×10-5mol·L-1, the concentration of MYT is 0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5, 1.50×10-5mol·L-1 from 1 to 7, respective-ly); (b) Stern-Volmer plots for MYT and Tryp

熒光猝滅包括靜態猝滅與動態猝滅[9],上述2種類型的猝滅效率均遵循Stern-Volmer方程,為了探究MYT猝滅Tryp的方式,可以通過式(2)對熒光實驗數據作進一步分析。

(2)

其中:F0與F分別為MYT加入前后Tryp的熒光強度,為猝滅劑MYT的質量濃度;Ksv為Stern-Volmer方程猝滅常數。如果Stern-Volmer方程猝滅常數Ksv≥2.0×102L·mol-1·s-1,則可認為熒光猝滅為靜態猝滅[10]。

圖2(b)為溫度在17, 27, 37 ℃時Tryp:MYT的F0/F與[Q]的關系圖,F0/F對[Q]的線性擬合結果見表1。結果表明,在17, 27, 37 ℃時,Ksv≥2.0×102L·mol-1·s-1,由此可以判斷出兩者間相互作用機理屬于靜態猝滅,且Tryp:MYT復合物較為穩定。

Tryp和MYT的結合常數KA與結合位點數n可通過雙對數方程(3)[11]獲得,所得結果見表1。

(3)

通過表1中的數據可以看出,隨著溫度的不斷上升,Tryp:MYT復合物的KA呈現出升高的趨勢。3個溫度下的n都約為1,因此,Tryp與MYT以接近1∶1的比例形成復合物,且復合物的組成相對穩定,沒有因溫度的改變而發生較大的改變。

表1 3種溫度下Tryp和MYT相互作用的結合常數Table 1 Binding parameters of the interaction between Tryp and MYT at three temperatures

為了判斷Tryp同MYT之間的相互作用力,使用Van’t Hoff方程(4)繪制lnKA與1/T的關系圖,熱力學常數ΔH,ΔS與ΔG均通過直線的截距和斜率得到[12],計算結果見表2。

(4)

根據已報道的結果[13],熱力學常數的符號和大小與結合過程中各種單獨的相互作用有著密切的關系。Tryp同MYT之間相互作用的熱力學常數ΔH>0,ΔS>0,ΔG<0,因此可見Tryp:MYT復合物為自發形成,且疏水作用在Tryp與MYT結合過程中起到了重要的驅動作用。由于MYT結構中存在很多活潑羥基,所以Tryp同MYT的結合過程也可能受氫鍵影響。

表2 3種溫度下Tryp:MYT復合物的熱力學參數Table 2 Thermodynamic parameters of Tryp: MYT complex at three temperatures

2.2 同步熒光光譜分析

同步熒光光譜法可用于研究客體對蛋白質結構的影響,波長差Δλ為15 nm的譜圖能夠反映出客體對蛋白質Tyr, His, Phe等殘基的影響,而Δλ為60 nm的譜圖可提供客體單獨對蛋白質Trp殘基的影響情況[14]。圖3是波長差Δλ為15和60 nm的Tryp:MYT復合物的同步熒光光譜。隨著MYT的質量濃度從0增加到1.5×10-5mol·L-1,圖4(a)與(b)圖中Tryp的熒光強度發生較大程度的下降,分別下降了41.86%和42.81%,說明在MYT與Tryp復合后,對Tyr, Phe, His以及Trp殘基的影響程度基本相同。

圖3 Tryp與不同質量濃度MYT的同步熒光光譜(溫度為37℃;pH為8.4;Tryp濃度為5.0×10-5mol·L-1;MYT濃度分別為0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5及1.5×10-5mol·L-1) (a) Δλ=15nm; (b)Δλ=60nmFig.3 The synchronous fluorescence spectra of Tryp with different concentrations of MYT tem-perature is 37℃; pH is 8.4; tryp concentration is 5.0×10-5mol·L-1; MYT concentration is 0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5 and 1.50×10-5mol·L-1, respectively) (a) Δλ=15nm; (b) Δλ=60nm

2.3 分子模擬

2.3.1 分子對接

為了進一步了解Tryp對MYT的識別,認識主客體之間的相互作用情況,本文通過Autodock FR程序[6]模擬了主客體之間的分子對接[15],圖4給出了得分最高的分子對接結果。由圖4可見,MYT結合在Tryp表面,主客體之間存在多個氫鍵及疏水作用,MYT與Tryp的Tyr39,His40及Ile73等殘基之間存在顯著的疏水作用,同時,MYT還與Asn34, Asn74, Trp141, Pro152等氨基酸殘基存在氫鍵作用。

圖4 MYT與Tryp相關殘基的氫鍵(實線)和疏水作用(虛線)Fig.4 Hydrogen bonds (solid lines) and hydrophobic (dashed lines) interactions of MYT with pertinent residues of Tryp

圖5 MYT與Tryp的均方根差 (RMSD)Fig.5 Root mean square deviation (RMSD) of MYT and Tryp

2.3.2 分子動力學模擬

將分子對接得分最高的結果導入到一個立方體水箱中,在30 ns內進行分子動力學模擬,并研究對接結果的分子動力學穩定性。分子動力學模擬過程中Tryp與MYT的均方根差(root mean square deviation, RSMD)隨時間變化的結果如圖5所示。

由圖5可見,Tryp與MYT在1.5 ns左右達到平衡,在隨后的模擬時間內主客體的RMSD整體上波動相對較小,表明主客體構象變化不大,在30 ns時間內主客體的平均RMSD分別為1.672與1.255 ?。分子動力學模擬表明,Tryp:MYT復合物結構穩定,與分子對接結果相吻合。

圖6 Tryp與MYT的相互作用柱狀圖Fig.6 Histogram graph of interactions between Tryp and MYT

圖6給出30 ns分子動力學軌跡中Tryp與MYT的相互作用情況,可以觀察到在整個分子動力學模擬過程中,Tyr39, His40, Phe41, Trp141, Tyr151, Pro152, Gly193等殘基與MYT之間在較長時間(大于總時間50%)保持相互作用,主客體間相互作用包括疏水、氫鍵及水橋作用,此結果與分子對接結果相符,表明30 ns分子動力學模擬并未改變主客體之間的相互作用類型。由此可見,Tryp:MYT復合物具有較好的動力學穩定性。

3 結 語

本文的實驗結果表明,在pH=8.4的條件下,溫度分別為17, 27, 37 ℃時,MYT可以有效地猝滅Tryp的熒光發射。根據Stern-Volmer方程以及雙對數方程求得MYT猝滅Tryp的機制為靜態猝滅。使用Van’t Hoff方程求得主客體結合的熱力學常數 ΔH>0,ΔS>0,ΔG<0,表明復合物的形成是一個熵增加且吸熱的自發過程,疏水與氫鍵作用對于復合物的形成具有促進作用。隨后本文利用同步熒光法研究Tryp與MYT的結合位點,結果表明MYT與Tryp的結合對Tyr, Phe, His以及Trp殘基的影響基本相同。分子對接表明,MYT結合在Tryp表面,通過疏水作用以及氫鍵作用與Tryp結合。分子動力學模擬表明,Tryp:MYT復合物的動力學性質穩定,在30 ns時間內主客體的平均RMSD分別為1.672 ?與1.255 ?。本研究有助于深入了解MYT與Tryp的相互作用機制,為藥物小分子與大分子結合研究提供了基礎數據及依據。