miRNA-205-3p 在川崎病合并巨大冠脈瘤中的作用機制探討

鄭洋 張慧 李曉惠 張明明 林瑤 石琳

首都兒科研究所附屬兒童醫院心血管內科，北京 100020

川崎病（Kawasaki disease，KD）又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，是一種血管炎癥綜合征，可累及全身多器官，以心血管后遺癥最為嚴重，包括冠狀動脈擴張、冠狀動脈瘤、血栓形成及心肌梗死[1-3]。巨大冠脈瘤（giant coronary artery aneurysm，GCAA）是冠狀動脈瘤最嚴重的類型，可持續存在并進展，是導致KD 合并血栓形成及心肌梗死的最主要原因，嚴重危害兒童身心健康[4]。如何早期預警這些高危患兒并積極干預是目前亟待解決的臨床與科學問題。微RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為18～25 個堿基的內源性非編碼RNA，通過降解靶基因mRNA 或抑制mRNA 的翻譯發揮生物學功能[5-6]。近年來有關miRNA 的研究表明，部分異常表達的miRNA 與癌癥及心血管疾病密切相關[7-10]。有研究提示miRNA 可能成為KD 早期診斷標志物[11]，但有關miRNA 與GCAA 形成的相關機制鮮有報道。本研究探索miRNA-205-3p 在KD 合并GCAA 發病中的作用機制，并在動物模型上進行驗證，為GCAA 的早期診斷和發生機制探索提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 選取2018 年11 月至2021 年2 月于首都兒科研究所附屬兒童醫院（以下簡稱“我院”）心內科住院治療的KD 患兒36 例，其中KD 組30 例，KD 合并GCAA 組6 例。按頻數匹配同期年齡、性別的于我院體檢的健康對照兒童和明確病原的發熱對照患兒各20 例（KD 組及KD 合并GCAA 組∶健康對照組∶發熱對照組=1.8∶1∶1）。本研究通過我院倫理委員會審批（SHERLL2018020）。

納入標準：①川崎病患兒診斷標準參照2017 年美國心臟協會指南[3]；②發熱患兒為經呼吸道病毒7項檢測明確病原體的急性呼吸道感染患兒。排除標準：川崎病患兒：①合并其他部位血管瘤；②臨床資料不完整；③家長拒絕參與研究。發熱患兒：①不明原因發熱患兒；②病毒感染累及下呼吸道患兒。

1.1.2 實驗動物 3～4 周齡C57BL/6 SPF 級健康雄性小鼠共12 只，體重（16.43±0.91）g，采購自北京維通利華實驗動物有限公司[許可證號SCXK（京）2016-0006；合格證號No.110011211104810921]，于屏障環境下飼養，人工控溫22～26℃，室內照明14 h∶10 h 明暗交替。符合我院動物倫理要求。

1.2 實驗方法

1.2.1 血液樣本采集 KD 組及KD 合并GCAA 組標本采樣于患兒入院確診后，開始靜脈用人免疫球蛋白治療前，于清晨空腹留取靜脈血2 ml，置于EDTA 抗凝管，于4℃，1760 g 離心5 min，將上層血漿和下層血細胞分開收集于1.5 ml 無菌離心管中，于-80℃冰箱保存。健康對照組及發熱對照組于清晨空腹留取靜脈血2 ml，樣本處理同前。

1.2.2 基因芯片分析及熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）驗證 通過基因芯片分析KD 組、KD 合并GCAA 組、健康對照組、發熱對照組（每組3 例）差異表達的miRNA。按照TRIzol（美國，Thermo，15596026）試劑說明提取總RNA；采用逆轉錄試劑盒（中國，生工生物工程，B532451）進行miRNA 的逆轉錄和擴增；采用qPCR 試劑盒（中國，生工生物工程，B532461）進行qPCR。逆轉錄及擴增體系：2×miRNA RT Solution Mix 10 μl、miRNA RT Enzyme Mix 2 μl、RNA 2 μl（總量約為2 μg）、RNase-Free Water 6 μl 制成反應體系20 μl；反應條件：37℃，60 min，85℃，5 min，4℃；qPCR 反應體系：2×miRNA qPCR Master Mix 10 μl、miRNA 正向引物0.5 μl、miRNA 反向引物0.5 μl、cDNA 2 μl、ROX Referrence Dye（H）1 μl、RNase-Free Water 6 μl 制成反應體系20 μl；qPCR 反應條件：95℃，30 s 預變性；95℃，5 s 變性；60℃，30 s 退火/延伸；循環40 次，記錄反應CT 值。使用2-△△Ct法計算miRNA 的相對表達量。人miRNA-205-3p 引物序列：正向引物為5’-CGCGGATTTCAGTGGAGTGAAGTTC-3’；反向引物為3’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-5’；內參U6序列：正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物為3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’。

1.2.3 生物信息學分析 通過DIANA TOOLS-mir-Pathv.3、KEGG 分析查詢所有差異表達miRNA 的相關信號通路，分析與KD 組及KD 合并GCAA 組發生的相關通路。

1.2.4 小鼠模型構建及心臟組織mRNA 水平測定 選取3～4 周齡C57BL/6 SPF 級雄性小鼠12 只，采用隨機數字表法分為KD 合并冠狀動脈病變（coronary artery lesion，CAL）組及對照組，每組6 只。KD 合并CAL 組小鼠腹腔注射干酪乳桿菌細胞壁成分（中國，CICC，6104）0.5 ml（濃度1 mg/ml），對照組注射磷酸鹽緩沖液0.5 ml；人工控溫22～26℃，室內照明14 h∶10 h 明暗交替，自由飲水進食。于第2 周麻醉后在超聲下觀察小鼠的冠脈擴張情況；麻醉后處死小鼠，摘取心臟組織，制作病理切片并觀察冠脈情況，若周圍有炎癥細胞浸潤，證明造模成功[12]。其余心臟組織液氮速凍后置于-80℃保存。

按照RNeasy Mini Kit 試劑盒（德國，Qiagen，74104）說明提取鼠心臟組織mRNA；采用逆轉錄試劑盒（加拿大，Abm，G492）進行mRNA 的逆轉錄和擴增；采用qPCR 試劑盒（加拿大，Abm，M-LR）進行qPCR。逆轉錄及擴增體系：AccuRT Reaction Mix (4×) 2 μl、RNA 2 μl（總量約為2 μg）、RNase-Free Water 4 μl（定容至8 μl），于室溫靜置5 min，再加入AccuRT Reaction Stopper(5×) 2 μl，搖勻，加入5×All-In-One Rt Master Mix 4 μl、RNase-Free Water 6 μl 制成反應體系20 μl；反應條件：25℃，10 min，42℃，15 min，85℃，5 min，qPCR 反應體系：EvaGreen 2×qPCR Master Mix 10 μl、mRNA 正向引物0.6 μl、mRNA 反向引物0.6 μl、cDNA 1 μl、RNase-Free Water 7.8 μl 制成反應體系20 μl；反應條件及表達量測量方法同“1.2.2”。mRNA-轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）引物序列：正向引物為5’-TTGCTTCAGCTCCA-CAGAGA-3’；反向引物為3’-TGGTTGTAGAGGGC-AAG GAC-5’；mRNA-SMAD5引物序列：正向引物為5’-GATTGTTGGGCTGGAAACAAG-3’；反向引物為3’ -CTCCATAGCACCCTTCTTCTTC-5’；內參GAPDH 序列：正向引物為5’-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3’；反向引物為3’-GAGTTGTCATATTTCTCGTGG-5’。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0 對所得數據進行統計學分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗；非正態分布的計量資料采用中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，比較采用Kruskal-Wallis 非參數檢驗。計數資料采用例數表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人口學信息

本研究中共收集KD 患兒36 例，其中KD 組30 例，平均年齡（2.33±1.31）歲，男∶女=2∶1；KD 合并GCAA組6 例，平均年齡（1.28±0.54）歲，男∶女=2∶1；按頻數匹配健康對照組20 名，平均年齡（2.71±1.71）歲，男∶女=3∶1；發熱對照組20 例，平均年齡（2.96±1.42）歲，男∶女=2.3∶1（KD 組及KD 合并GCAA 組∶健康對照組∶發熱對照組=1.8∶1∶1）。各組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。

2.2 基因芯片分析

通過基因芯片分析KD 組、KD 合并GCAA 組、健康對照組及發熱對照組，各組間差異表達＞10 倍且P ＜0.05 的miRNA 共12 個。基因芯片結果見表1。

2.3 各組miRNA-205-3p 表達量比較

KD 組miRNA-205-3p 表達量高于健康對照組及發熱對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；KD 合并GCAA 組miRNA-205-3p 表達量高于健康對照組、發熱對照組及KD 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組miRNA-205-3p 表達量比較[M（P25，P75）]

2.4 生物信息學分析結果

miRNA-205-3p 在MAPK 信號通路及TGF-β/SMAD5 信號通路中作用顯著。見表3、圖1～2。

表3 miRNA-205-3p 部分相關通路及涉及靶基因

2.5 小鼠模型心臟組織病理切片

鏡下可見KD 合并CAL 組小鼠心臟冠狀動脈周圍炎癥細胞增多；對照組小鼠無明顯炎癥細胞浸潤，證明造模成功。見圖3。

2.6 TGF-β/SMAD5 信號通路在冠脈損傷小鼠心臟組織中的表達

KD 合并CAL 組小鼠心臟組織TGF-β1 mRNA 表達量（3.93±2.42）高于對照組（1.42±1.23），差異有統計學意義（t=2.272，P ＜0.05）；KD 合并CAL 組小鼠心臟組織SMAD5 mRNA 表達量（2.98±1.53）高于對照組（1.05±0.34），差異有統計學意義（t=3.040，P ＜0.05）。

3 討論

近年來，KD 的發病率有增高趨勢，成為兒童獲得性心臟疾病的主要病因。KD 合并GCAA 可能會引起血栓形成、瘤體破裂甚至猝死等嚴重結局[4]，目前發生機制仍不清楚。本研究發現miRNA-205-3p 在KD 及KD 合并GCAA 患兒中表達水平明顯升高；經生物信息分析和動物模型驗證，提示miRNA-205-3p 可能通過TGF-β/SMAD 通路參與KD 及GCAA 形成。

miRNA-205-3p 可在多種RNA 信號軸中起作用[13]。研究發現，miRNA-205-3p 在膠質瘤及胃癌中可通過TGF-β 調節上皮-間充質細胞轉換[14-15]，提示miRNA-205-3p 通過TGF-β 信號通路在多種疾病中發揮病理作用。TGF-β 參與心血管系統多種生理和病理變化的調節，如誘導心肌細胞肥大、纖維化和鈣化[16-17]。SMAD5 是一種受體激活型SMADs，可直接被TGF-β磷酸化激活并參與其信號通路的調控[18-19]，其缺失可能導致細胞穩態發生變化。Cho 等[20]針對SMAD5 的基因多態性進行分析，發現與KD 相關的SNP 分型。

TGF-β/SMAD5 信號通路可引發心臟結構的病理變化：通路的激活可促進細胞外基質的生成和細胞環境的改變，引發病理變化[21-22]。當TGF-β/SMAD5 表達升高時，彈力板和膠原纖維彈性被破壞，血管壁收縮功能及強度下降，冠脈結構和功能的完整性受損，在高速沖擊的血流下，出現血管壁擴張，最終導致KD 的病理改變；同時，激活的TGF-β/SMAD 通路可以導致內皮功能障礙[23]，TGF-β 可通過SMAD 通路，包括SMAD1/5 信號促進上皮-間充質細胞轉換等一系列病理變化，改變細胞表型和功能，介導血管瘤的形成[24-27]。本研究通過構建小鼠模型，驗證了TGF-β/SMAD5 通路在KD 中的促進作用。

本研究的不足在于：KD 合并GCAA 的發病率較低，使病例數較少，如果有條件，可在擴大GCAA 患兒樣本量的情況下再次驗證；探索出的作用機制有待經過后續細胞實驗、動物實驗等進一步驗證。

綜上所述，本研究發現在KD 及KD 合并GCAA 患兒中，miRNA-205-3p 的表達水平升高，提示miRNA-205-3p 可能作為KD 診斷及早期評估病情嚴重程度的生物標志物，其作用機制可能通過TGF-β/SMAD5信號通路。該研究為KD 合并GCAA 的發病機制研究提供了新靶點。