miRNA-142-5p 和RPN2 在膠質瘤中的表達及臨床意義

蘇靜 趙雋 梁瓊

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腫瘤科，上海 200021

膠質瘤是源于中樞神經(jīng)上皮的惡性腫瘤，占顱腦腫瘤的40%以上[1]。膠質瘤的治療包括手術及放化療等，但易復發(fā)和產(chǎn)生耐藥性[2]。微RNA（microRNA，miRNA）-142-5p 編碼基因位于17q22，轉錄后調控下游靶基因的表達[3]。研究表明，在多種腫瘤中miRNA-142-5p 異常表達，能夠調控腫瘤細胞增殖、凋亡及轉移等行為，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。核糖蛋白2（ribophorin 2，RPN2）屬于粗面內質網(wǎng)中Ⅰ型整合膜蛋白，參與分泌蛋白的轉運，在肝癌、胃癌等腫瘤中能促進N-糖基化P-糖蛋白的糖基化并破壞其膜定位，促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展[6-9]。本文通過研究miRNA-142-5p、RPN2 在腦膠質瘤中的表達，探討兩者的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月至12 月上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院收治的85 例膠質瘤患者。納入標準：①首次手術，術前無任何形式的腫瘤治療；②經(jīng)病理學檢查確認為膠質瘤；③能夠配合隨訪，資料完整。排除標準：①合并其他器官腫瘤；②罹患心肌梗死、腦卒中等急危重癥疾病；③伴腦積水或腦部手術史。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過（20181211）。

1.2 研究方法

1.2.1 qRT-PCR 檢測miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 的表達 選取膠質瘤患者手術切除的癌組織及癌旁正常組織（距離癌組織>0.5 cm），應用Trizol 提取RNA，微量分光光度計檢測RNA 的濃度和純度。將RNA 反轉錄形成cDNA。qPCR 檢測：miRNA-142-5p 正向引物序列：5’-GGCCCATAAAGTAGAAAGC-3’，反向引物序列：5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’；U6 正向引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列：3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’；RPN2 正 向引物序列：5’-CAAAGTCACCGGACAAGGTC-3’，反向引物序列：5’-TGGTGTTCCGAAGTTGGTCA-3’；GAPDH 正向引物序列：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，反向引物序列：5’-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3’。qPCR 總體系20 μl：cDNA 模板1 μl，正反向引物各1 μl、SYBR Green 10 μl 及雙蒸水7 μl。qPCR 條件：94℃預變性2 min，94℃變性15 s，62℃退火30 s，65℃延伸10 s，共35 個循環(huán)。2-ΔΔCt法表示miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 的相對表達量。分別根據(jù)癌組織中miRNA-142-5p、RPN2 相對表達量的均值為界，分為高表達組和低表達組。

1.2.2 免疫印跡檢測 組織研缽研磨，RIPA 裂解后BCA 法蛋白定量，進行免疫印跡檢測。電泳后濕轉法轉膜。5%脫脂奶封閉2 h，一抗4℃孵育過夜（RPN2兔多克隆抗體購自Abcam，ab244399），山羊抗兔二抗室溫孵育1 h。ECL 暗室顯影照相，應用Image J 軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.2.3 熒光素酶實驗驗證miRNA-142-5p 與RPN2的相互作用 pmiRNAGLO-RPN2-WT、pmiRNAGLORPN2-MUT 及miRNA-142-5p mimic 由華大公司設計合成。雙熒光素酶測定系統(tǒng)（E1910，Promega，美國）和微板發(fā)光計（11300010，Berthold，德國）測定熒光素酶活性。將HEK293T 細胞以6×104細胞/孔密度接種到24 孔板，將pmiRNAGLO-RPN2-野生型（wild type，WT）或pmiRNAGLO-RPN2-突變型（mutant，MUT）報告基因分別與miRNA-142-5p mimic 共轉染，分別作為RPN2 WT+miRNA-142-5p mimic 組和RPN2 MUT+miRNA-142-5p mimic 組。以單純傳染pmiRNAGLORPN2-WT 或pmiRNAGLO-RPN2-MUT 為RPN2 WT組和RPN2 MUT 組。轉染48 h 后測定熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性進行標準化。

1.2.4 隨訪 患者自病理確診起進行隨訪，每個月電話隨訪1 次，隨訪的內容為患者生存及疾病進展情況，隨訪截止至隨訪結束（2020 年12 月）或患者死亡。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)表示。采用Kaplan-Meier 生存曲線法（logrank 檢驗）分析不同表達水平患者的3 年生在率。。相關檢驗為Pearson 相關分析。在線生物信息學軟件Targetscan 預測miRNA-142-5p 與RPN2 的相互作用（http：//www.targetscan.org/mamm_31/）。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-142-5p 及RPN2 的表達

miRNA-142-5p 在膠質瘤組織中的相對表達量低于癌旁正常組織[（0.612±0.137）和（1.679±0.286），t=31.021，P <0.001]，而RPN2 mRNA 在膠質瘤組織中的相對表達量高于癌旁正常組織[（1.833±0.314）和（0.412±0.047），t=41.263，P <0.001]。膠質瘤組織中RPN2 蛋白表達明顯高于癌旁正常組織[（1.112±0.247）和（0.423±0.044），t=5.752，P <0.001]。

2.2 miRNA-142-5p 與RPN2 mRNA 的相關性及相互作用預測

相關性分析顯示，miRNA-142-5p 與RPN2 mRNA表達呈負相關（r=-0.604，P ＜0.001）。RPN2 mRNA第596～621 堿基含有與miRNA-142-5p 互補結合位點。見圖1A。與RPN2 WT 組及RPN2 MUT+miRNA-142-5p mimic 組 比 較，RPN2 WT+miRNA-142-5p mimic 組的熒光素酶活性降低（P ＜0.05）。見圖1B。

圖1 miRNA-142-5p 靶向抑制RPN2 基因表達

2.3 臨床參數(shù)與miRNA-142-5p 和RPN2 mRNA 表達的關系

以癌組織中miRNA-142-5p 相對表達量的均值0.612 為界，分為高表達組42 例，低表達組43 例；以RPN2 的均值1.833 為界，分為高表達組41 例，低表達組44 例。不同卡氏功能狀態(tài)（Karnofsky performance status，KPS）評分及世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分級膠質瘤患者的miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），不同年齡、性別、腫瘤直徑、侵犯腦葉數(shù)的膠質瘤患者miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 臨床參數(shù)與miRNA-142-5p 和RPN2 mRNA 表達的關系（例）

2.4 miRNA-142-5p 與RPN2 mRNA 表達對預后的影響

隨訪1～36 個月，無失訪患者，死亡30 例。3 年總體生存率為64.7%（55/85），中位生存期為23.25（15.21，26.63）個月。miRNA-142-5p 低表達組中位生存期為18.21（14.21，25.63）個月，低于高表達組[26.10（19.34，33.15）個月]（log-rank χ2=9.247，P=0.038）。RPN2 高表達組患者中位生存期為19.30（15.07，26.21）個月，低于低表達組[25.60（17.19，32.54）個月]（log-rank χ2=8.226，P=0.010）。

3 討論

膠質瘤是最常見的顱腦原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展涉及復雜的分子機制。miRNA 是內源基因編碼的長度為19～25 個核苷酸的單鏈RNA 分子，不僅在個體生長發(fā)育及凋亡等生理過程中發(fā)揮重要的作用，還參與心血管疾病、腫瘤等的病理學過程[10-13]。miRNA-142 基因位于17q22，能夠編碼產(chǎn)生具有發(fā)夾結構的miRNA-142-5p，在癌癥、炎癥、免疫失調等方面起著關鍵作用[14-17]。本研究發(fā)現(xiàn)癌組織中miRNA-142-5p的表達明顯下調，且不同WHO 分級及KPS 評分患者miRNA-142-5p 表達不同，提示miRNA-142-5p 的低表達參與促進腫瘤的惡性進展。Li 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-142-5p 的表達受到長鏈非編碼RNA LOXL1-AS1 的表達調控，LOXL1-AS1 能夠結合并抑制miRNA-142-5p 的表達及功能，腫瘤發(fā)生時LOXL1-AS1的過度表達導致miRNA-142-5p 水平降低，下游癌基因PIK3CA 過度活化，導致腫瘤惡性增殖及轉移。此外，miRNA-142-5p 低表達與患者不良生存預后有關。可能是因為膠質瘤中miRNA-142-5p 表達降低導致下游腫瘤干性基因Sema3C 的異常活化，并且導致膠質瘤患者的不良生存預后[19]。

RPN2 是高度保守的糖蛋白，位于粗糙內質網(wǎng)膜中，參與粗面內質網(wǎng)物質轉運和結構維持[20]。RPN2 蛋白是寡糖基轉移酶復合物的一部分，能將新生甘露糖寡糖與新生多肽鏈的NXST 共有基序中的天冬酰胺殘基結合[21]。此外，研究顯示，RPN2 基因敲低可以誘導結腸癌細胞凋亡并抑制遷移和侵襲[22]。本研究結果顯示，癌組織中RPN2 mRNA 和蛋白表達水平升高，并且與WHO 分級及KPS 評分有關，提示RPN2 可能作為一種致癌基因，促進膠質瘤的疾病進展。研究顯示，RPN2 通過介導表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的糖基化，激活EGFR/ERK 信號通路的信號傳導，進而促進腫瘤細胞惡性增殖，而RPN2 沉默通過EGFR 去糖基化降低了EGFR 向細胞表面的轉運，抑制下游ERK 信號的傳導[23]。此外，癌組織中RPN2 的高表達提示患者不良生存預后。可能是因為RPN2 能夠促進多藥耐藥基因編碼蛋白P-糖蛋白的糖基化，促進P-糖蛋白的膜定位，促進癌細胞對多西紫杉醇等化療藥物耐藥性形成，導致患者預后不佳[24-25]。本研究顯示miRNA-142-5p 與RPN2 在癌組織中呈負相關，同時，生信預測結果發(fā)現(xiàn)兩者存在相互結合的位點，提示兩者可能存在相互作用關系，熒光素酶報告基因實驗進一步顯示膠質瘤中RPN2受到miRNA-142-5p 的轉錄后表達調控。Ou 等[26]報道m(xù)iRNA-142-5p 與RPN2 在腫瘤中能夠共同調控EGFR 信號通路，兩者的表達具有協(xié)同作用，共同促進腫瘤的惡性進展。

綜上所述，膠質瘤中miRNA-142-5p 表達下調，而RPN2 表達上調，兩者呈顯著負相關，共同參與膠質瘤的惡性進展。