C-末端Src 蛋白/黏著斑激酶/上皮鈣黏素通路在宮頸癌侵襲轉移中的作用及機制研究

唐群華 母小琴 黃仕蘭 唐志康 廉曉玲

湖南醫藥學院第一附屬醫院婦科，湖南懷化 418000

宮頸癌嚴重威脅女性的生命和健康[1]，中晚期患者由于淋巴結和遠處轉移，導致臨床療效不佳[2]。上皮鈣黏素（E-cadherin，E-cad）是重要的上皮細胞固有黏附分子，也是上皮性腫瘤侵襲轉移的抑制分子[3-4]。C-末端Src 蛋白（C-terminal Src protein，c-Src）/黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）作為互助型復合體具有重要的信號調控功能[5-6]。本研究以宮頸癌組織及細胞系為研究對象，探討c-Src/FAK/E-cad 通路在宮頸癌侵襲轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選取宮頸鱗癌（cervical squamous cell carcinomas，CSCC）組織標本30 例、正常宮頸（normal cervical，NC）組織標本30例，以上石蠟標本均來源于2019 年1 月至2020 年12 月湖南醫藥學院第一附屬醫院（以下簡稱“我院”）病理科，其中CSCC 中Ⅰ期5 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期10 例，Ⅳ期8 例。另選取我院術中采集的CSCC、NC 組織各1 例。宮頸癌Caski 細胞系來源于我院中心實驗室。c-Src 抑制劑（AZD0530）購自碧云天生物技術公司，分子量542 kD。宮頸癌Caski 細胞系分為Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組，Caski 組不進行處理，Caski+c-Src 抑制劑組加入c-Src 抑制劑，使用濃度為2.7 nmol/L[7]。本研究經我院醫學倫理委員會審批。

1.2 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學染色觀察CSCC 與NCT 中E-cad 陽性率。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法，按試劑盒（福州邁新生物技術公司，KIT-9720）說明書操作。步驟如下：CSCC、NC 石蠟標本常規脫蠟切片，加一抗，濃度為c-Src（1∶500），4℃冰箱過夜后加入二抗（1∶500）；辣根過氧化物酶法顯色，蘇木精復染，常規脫水，透明，干燥，封片。結果判斷[8]：①按染色深度評分。無染色記為0 分，淺黃色記為1 分，棕黃色記為2 分，深棕色記為3 分。②按陽性細胞比率評分。陽性細胞數占總細胞數＜10%記為0 分；10%～＜25%記為1 分；25%～＜50%記為2 分；≥50%記為3 分。③2 項評分相加。0～1 分為陰性，2 分為弱陽性，3～4 分為陽性，5～6 分為強陽性。陽性率=（弱陽性+陽性+強陽性）/總數×100%。

1.3 E-cad 表達情況與CSCC 臨床病理特征關系

收集30 例CSCC 患者的臨床病理特征，包括年齡、國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obste-trics，FIGO）分期、分化程度、復發情況、淋巴結轉移情況，分析其與E-cad 表達情況的關系。

1.4 Western blot 檢測c-Src、FAK、E-cad 蛋白表達水平

采用Western blot 觀察CSCC、NC 組織中c-Src、FAK、E-cad 蛋白的表達情況。CSCC、NC 組織剪碎研磨，加裂解液；4℃，12000 g 條件下離心30 min，吸取上清液為蛋白樣品；水浴變性；SDS-PAGE 電泳；將分離膠中蛋白轉到PVDF 膜上；麗春紅染色；脫脂奶粉封閉；將PVDF 膜放入雜交袋中，加封閉液和一抗（c-Src、FAK、E-cad 濃度均為1∶1000），冰箱中過夜；加封閉液和二抗，濃度1∶1000；掃描凝膠并照相。Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組無需前處理，直接檢測即可。實驗重交3 次。

1.5 侵襲及遷移實驗

侵襲實驗：首先將Matrigel 膠與無血清培養基按1∶100 混合，浸泡小室，在上腔加100 μl 基質膠，紫外線消毒殺菌過夜；上腔加200 μl，下腔加600 μl 無血清培養基；收集細胞，密度為2×105個/ml，上下腔中加入200 μl 細胞，并加入含10%胎牛血清的1640 培養基，48 h 后取出，加無水乙醇固定，結晶紫染色，計數10 個高倍視野中細胞數目。遷移實驗不需要Matrigel膠，其余步驟同侵襲實驗。

1.6 流式細胞術

采用流式細胞術觀察c-Src 抑制劑對Caski 細胞系凋亡的影響。Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組分別用胰蛋白酶消化細胞，制成懸液，保留沉淀加入緩沖液，將細胞吹打均勻，加入Annexin V 及染色劑，混勻，計算機檢測細胞凋亡率。實驗重交3 次。

1.7 統計學方法

采用SPSS 18.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，比較采用t 檢驗；計數資料采用例數表示，比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 CSCC、NC 組織標本中E-cad 陽性率比較

NC 組織標本的E-cad 陽性率（76.7%，23/30）高于CSCC 組織標本（26.7%，8/30），差異有統計學意義（χ2=15.017，P ＜0.001）。見圖1。

圖1 宮頸鱗癌、正常宮頸組織標本中上皮鈣黏素陽性率比較（免疫組織化學染色，200×）

2.2 CSCC 患者臨床病理特征與E-cad 的表達的關系

E-cad 表達與CSCC 患者的FIGO 分期、分化程度、復發情況相關聯（P ＜0.05）。見表1。

表1 CSCC 患者臨床病理特征與E-cad 的表達的關系（例）

2.3 CSCC、NC 組織中c-Src、FAK、E-cad 蛋白表達水平比較

CSCC 組織中c-Src、FAK 表達水平高于NC 組織，E-cad 表達水平低于NC 組織，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 NC 組織、CSCC 中c-Src、FAK、E-cad 蛋白表達水平比較（n=3）

2.4 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組細胞侵襲、遷移能力比較

Caski+c-Src 抑制劑組侵襲、遷移細胞計數均低于Caski 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組細胞侵襲、遷移能力比較（個/10 HP，±s，n=3）

表2 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組細胞侵襲、遷移能力比較（個/10 HP，±s，n=3）

2.5 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組細胞凋亡率的比較

Caski+c-Src 抑制劑組細胞凋亡率為（14.6±0.8）%，Caski 組細胞凋亡率為（5.1±0.2）%，Caski+c-Src 抑制劑組細胞凋亡率高于Caski 組，差異有統計學意義（t=19.953，P ＜0.001）。

2.6 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組c-Src、FAK、E-cad蛋白表達水平比較

Caski+c-Src 抑制劑組c-Src、FAK 蛋白表達水平低于Caski 組，E-cad 蛋白表達水平高于Caski 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 Caski 組、Caski+c-Src 抑制劑組c-Src、FAK、E-cad 蛋白表達水平比較（n=3）

3 討論

E-cad 缺失能夠誘導上皮間質轉化發生，導致腫瘤侵襲轉移能力增強[9-11]。在宮頸癌浸潤及轉移灶中大部分E-cad 表達缺失[12]。本研究發現，E-cad 在NC 組織中高于CSCC，且E-cad 表達與腫瘤分化程度、FIGO分期、復發有關，提示E-cad 表達與宮頸癌發生發展有關。

有研究發現，E-cad 表達和功能受c-Src/FAK 的調控[13]。c-Src 在調控細胞生長增殖、黏附等方面發揮重要作用[14-17]。FAK 是一種非受體酪氨酸蛋白激酶，是整合素信號的中心分子[18]；而整合素介導FAK 活化對于細胞播散和遷移至關重要[19]。

c-Src 和FAK 以c-Src/FAK 復合體形式于人體中存在并發揮作用[20]。c-Src/FAK 復合體參與調節細胞凋亡、遷移等病理生理過程[21-22]。在頭頸鱗癌、肺癌中，均存在FAK 高表達[23-25]。FAK 增高可促進腫瘤細胞遷移和侵襲能力[26-27]。FAK 在宮頸癌中高表達，且與宮頸癌惡性程度有關[28]。

本研究結果顯示，CSCC 組織中c-Src、FAK 表達增高，E-cad 表達下調，加入c-Src 抑制劑后，宮頸癌細胞侵襲和遷移能力下降，凋亡增多，宮頸癌細胞中c-Src、FAK 下調，E-cad 表達上調。

綜上，CSCC 中，c-Src 表達下調可引起FAK 下調和E-cad 表達上調，導致宮頸癌侵襲和遷移能力下降，可能與細胞凋亡增多有關，對于宮頸癌靶向治療具有重要意義。