探討環(huán)狀RNA標(biāo)記物診斷脊柱結(jié)核的潛在價(jià)值

黃志剛，馬克，劉晶

深圳市第三人民醫(yī)院骨科，廣東深圳 518115

脊柱結(jié)核是肺外結(jié)核類型中最常見的一類，占骨結(jié)核總數(shù)的1/2左右[1]。臨床診斷脊柱結(jié)核需綜合分析患者的臨床表現(xiàn)、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及影像學(xué)特征，但脊柱結(jié)核早期影像及臨床表現(xiàn)缺乏特異性，實(shí)驗(yàn)室檢查也不存在較典型的生化指標(biāo)[2]。因此，早期明確診斷脊柱結(jié)核的難度較大，常因此出現(xiàn)漏診、誤診情況而貽誤治療時(shí)機(jī)[3-5]。近年來微小RNA（miRNA）經(jīng)基因組學(xué)研究證實(shí)，可作為特異的生物標(biāo)記物用于脊柱結(jié)核及相關(guān)疾病的鑒別診斷，但關(guān)于circRNA的臨床研究十分罕見[6-8]。本研究選取2016年6月—2018年9月深圳市第三人民醫(yī)院收治的50例脊柱結(jié)核患者為研究對(duì)象，擬針對(duì)脊柱結(jié)核患者差異性表達(dá)circRNA予以篩查鑒定，旨在探討其作為早期診斷脊柱結(jié)核分子標(biāo)記物的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的50例脊柱結(jié)核患者作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：生長發(fā)育正常；年齡≥18歲；經(jīng)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查確診；均接受手術(shù)治療；脊柱結(jié)核活動(dòng)期同時(shí)具備嚴(yán)重骨質(zhì)破壞、較大寒性膿腫；行徹底病灶清除術(shù)；組織病理學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)干酪樣物質(zhì)或朗罕斯細(xì)胞和（或）結(jié)核桿菌組織標(biāo)本培養(yǎng)陽性；無其他可疑疾病；患者知曉本研究?jī)?nèi)容并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：早期影像學(xué)表現(xiàn)不明顯患者；合并其他（脊柱外）臟器結(jié)核病患者；骨病治愈型、靜止型脊柱結(jié)核患者；行器官移植、同種異體組織移植及人工假體植入患者；合并人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等自身免疫性疾病患者。另選擇同期進(jìn)行體檢的健康人員50名作為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：生長發(fā)育正常；年齡≥18歲；不存在結(jié)核病史；T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)及結(jié)核菌素（purified protein derivative,PPD）試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果呈陰性；無其他可疑疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集各抽取受試者2.5 mL空腹外周血，其中研究組外周血標(biāo)本包括治療前及術(shù)后治愈兩種，血液凝固后于4℃條件下離心10 min（1 700 g）收集上層血清，再離心10 min（2 000 g）收集上清液，通過低速離心去除沉淀成分，血清置于-20℃冰箱中凍存待檢。

1.2.2 circRNA提取應(yīng)用mirVana?PARIS?Kit提取血清循環(huán)circRNA，通過ND-1000分光光度計(jì)質(zhì)檢所提取的循環(huán)circRNA，其完整性檢測(cè)使用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳。

1.2.3 circRNA篩選①使用Agilent公司生產(chǎn)的miRNAs Complete Labeling and Hyb試劑盒對(duì)血清circRNA予以標(biāo)記反應(yīng)及去磷酸化。②將對(duì)等體積Pre-Hybridization Mix注入后實(shí)施芯片預(yù)雜交，將Pre-Hybridization Mix吸除并注入雜交液，再將芯片放在雜交爐中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)雜交。完成雜交后移除雜交液，將Wash Buffer A加入后對(duì)芯片進(jìn)行清洗染色，完成上述操作后實(shí)施芯片掃描。③聚類分析基因芯片數(shù)據(jù)。④通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）技術(shù)對(duì)circRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)篩選，并對(duì)特異型循環(huán)circRNA進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的circRNA表達(dá)水平，分析其與基因芯片篩選結(jié)果是否一致，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。在脊柱結(jié)核患者的血清中篩選出一組circRNA，建立circRNA表達(dá)譜模型。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

circRNA基因芯片初篩獲取存在表達(dá)差異circRNA36個(gè)，表達(dá)增高及降低的比例為15/21，見表1。經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，hsa-circRNA_400005表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與芯片檢測(cè)結(jié)果基本一致。聯(lián)合分析circRNA及miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，hsa-circRNA_400005與hsa-miR-19a-3p之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。聚類分析結(jié)果見圖1。

表1 差異表達(dá)circ RNA差異倍數(shù)及P值Table 1 Differential folds and P values of differentially expressed circRNAs

3 討論

circRNA通常是由大于1個(gè)的外顯子所構(gòu)成的一類環(huán)形RNA分子，被眾多研究人員認(rèn)為是非隨機(jī)的、穩(wěn)定的、豐富的、保守的RNA剪切產(chǎn)物[4]。circRNA可通過對(duì)miRNA表達(dá)的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)對(duì)親本基因細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄、RNA結(jié)合蛋白所參與的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的目的，這些均顯示出circRNA有診斷功能的良好潛力[9-12]。

本研究結(jié)果顯示，circRNA基因芯片初篩獲取存在表達(dá)差異circRNA36個(gè)，表達(dá)增高及降低的比例為15/21。經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，hsa-circRNA_400005表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），與芯片檢測(cè)結(jié)果基本一致。聯(lián)合分析circRNA及miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，hsacircRNA_400005與hsa-miR-19a-3p之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），說明circRNA的確會(huì)參與脊柱結(jié)核病理發(fā)展進(jìn)程。有研究指出，circRNA難以被miRNA、RNA酶降解，能夠更穩(wěn)定地對(duì)miRNA功能表達(dá)加以調(diào)控[13-14]。單個(gè)circRNA分子中蘊(yùn)含大量的MRE，可瞬間釋放或結(jié)合大量的miRNA，最終將調(diào)控作用高效發(fā)揮。聞芳等[15]認(rèn)為，作為miRNA上游分子的circRNA同時(shí)靶向miRNA，進(jìn)而對(duì)miRNA基因沉默作用加以抑制，很可能會(huì)在自噬作用中發(fā)揮重要作用，有力地證實(shí)circRNA參與脊柱結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展過程。

綜上所述，脊柱結(jié)核患者存在大量特異循環(huán)表達(dá)的circRNA及miRNA，但circRNA的穩(wěn)定性更高，可做為早期診斷脊柱結(jié)核更具潛力的分子標(biāo)記物。