注射用多西他賽聚合物膠束細菌內毒素定量檢測法的建立*

陳 莉 ，劉小艷 ，杜鵬飛 ，季文君 ，顧曉紅 ，潘爾卓 ，周 堅 △

（1. 蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104； 2. 蘇州海特比奧生物技術有限公司，江蘇 蘇州 215421）

革蘭陰性菌產生的內毒素是藥品污染導致毒性反應的最常見原因，其引起臨床發熱的活性遠高于其他已知熱原物質，因此在注射劑等臨床高風險劑型中，特別需要通過控制內毒素含量，預防臨床熱原反應和敗血癥等藥品不良反應的發生［1-2］。但細菌內毒素檢測在一些特殊制劑（如聚合物膠束溶液）的內毒素控制應用中仍存在問題。聚合物膠束易在較劇烈條件下如高濃度有機溶劑或高頻超聲下受到破壞［3-4］，而這些條件極可能干擾后續內毒素檢測，進一步降低檢測過程中內毒素的回收率。因此，在開發以聚合物膠束為載體的藥物的內毒素檢測方法時，必須找到既能破壞膠束穩定狀態，釋放潛在內毒素，又不影響內毒素檢測，避免低回收率或假陰性，用于藥品中內毒素含量控制和安全監測的方法。前期研究中探討了聚乙二醇單甲醚聚乳酸嵌段共聚物膠束特性，發現其疏水鏈在溶液中存在降解傾向［5］。故擬采用堿性溶液加速聚合物膠束溶解降價的方法破壞聚合物膠束后，再進行內毒素檢測，建立定量檢測方法，用于注射用多西他賽聚合物膠束的內毒素含量檢測，監控其質量和安全，也為其他類似聚合物膠束內毒素檢測方法的開發提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Robot 100 型全自動細菌內毒素檢測系統（湛江安度斯生物有限公司）；90PLUS ZETA 型動態激光粒度儀（測定范圍0.3 nm 至15μm，美國Brookhaven 儀器有限公司）。

1.2 試藥

注射用多西他賽聚合物膠束（蘇州海特比奧生物技術有限公司，批號分別為D19102313，D19102713，20141118，規格為每瓶0.5 g）；細菌內毒素工作標準品（批號為150800 - 201987，規格為每支80 EU），動態顯色法鱟試劑（批號為2004070，規格為每支0.35 mL，標示靈敏度0.01 EU/mL），細菌內毒素檢查用水（BET 用水，批號為1910150，規格為每瓶100 mL），均購自湛江安度斯生物有限公司；氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20200831）。

2 方法與結果

2.1 內毒素限值及最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

設定樣品細菌內毒素限值為 0.02 EU/mg［6］。根據公式MVD=cL/λ計算，其中，c為供試品質量濃度（本研究中為50 mg/mL），L為限值，λ為標準曲線的最低濃度（即鱟試劑靈敏度），則MVD=100倍（0.5 mg/mL）。

2.2 形態及粒徑表征

溶液制備：取樣品1 瓶，加BET 用水10 mL 溶解混勻，制成質量濃度為50 mg/mL的溶液；取1 mL，置100 mL容量瓶中，加BET用水定容，制成質量濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液Ⅰ。破壞注射用多西他賽聚合物膠束溶液，取樣品3 瓶，分別加以BET 用水配置成的pH 9，10，11的氫氧化鈉溶液10 mL溶解混勻，制成質量濃度均為50 mg/ mL 的溶液；取 1 mL，置 100 mL 容量瓶中，分別加上述pH9，10，11 的氫氧化鈉溶液定容，分別制成質量濃度均為0.5 mg/mL 的供試品溶液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ。采用激光粒度儀檢測上述供試品溶液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，取約2 mL，加入比色皿，以激光粒度儀直接測量，測量溫度為25 ℃。采用透射電鏡確認激光粒度儀檢測到的可破壞膠束溶液（且pH 最接近7）。觀察方法為，將聚合物膠束分散在水中得到膠束分散液，充分搖勻后，沾于銅網上，待網上液體將干時，滴加1%磷鎢酸溶液1滴進行負染，用濾紙吸去多余染液，銅網在室溫下自然晾干，透射電子顯微鏡下觀測，電壓設為100 kV［7］。

供試品溶液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ中僅供試品溶液Ⅱ的粒徑無明顯改變，詳見圖1。供試品溶液Ⅰ中膠束粒子的平均粒徑為22.74 nm，供試品溶液Ⅱ和Ⅲ中膠束粒子的平均粒徑分別為20.72 nm 和0.29 nm，破壞前后測定的平均粒徑和粒徑分布圖有一定差異。由于激光粒度儀本身檢測原理的限制，已無法檢測到供試品溶液Ⅳ中膠束粒子的粒度，故無法展示。透射電鏡結果見圖2。可見，供試品溶液Ⅰ中可觀察到邊緣較光滑的球狀膠束粒子，供試品溶液Ⅲ中的球狀粒子邊緣出現棱角，形狀不是規則球狀。結合2 種檢測方法的結果可判斷，樣品經pH10 的氫氧化鈉溶液溶解并稀釋為0.5 mg/ mL 的溶液時，膠束已被破壞。

圖1 注射用多西他賽聚合物膠束粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of Docetaxel Polymer Micelles for Injection

圖2 注射用多西他賽聚合物膠束溶液的透射電鏡圖（圖中標尺為1 μm）Fig.2 Transmission electron microscope photos of Docetaxel Polymer Micelles for Injection（the scale is 1 μm）

2.3 供試品干擾試驗

取樣品1 瓶，用10 mL pH10 的氫氧化鈉溶液溶解制成50 mg / mL 的供試品溶液Ⅴ，取1.6 mL，加入細菌內毒素工作標準品中溶解并渦旋混勻15 min，制成50 mg/mL（含細菌內毒素50 EU/mL）的供試品溶液Ⅵ，最后再用pH10 的氫氧化鈉溶液稀釋50 倍或100 倍制成供試品加標回收溶液；取適量，渦旋混勻15 min 后，用pH10 的氫氧化鈉溶液稀釋50 倍或100 倍，作為供試品溶液Ⅵ進行檢測，計算供試品溶液的加標回收率。加樣回收率=（供試品加標溶液的內毒素檢測值- 供試品溶液檢測值）/供試品加標溶液中標準品的理論值×100%。

結果見表1。可見，供試品溶液Ⅵ質量濃度為1.0，0.5 mg/ mL 時，其平均加標回收率分別為72.30%和91.81%，符合要求（50%～200%）；且在稀釋100倍后，其加標回收率接近100%，對檢測結果干擾較小。故確認，在供試品溶液中加入pH10的氫氧化鈉溶液不會破壞供試品中可能存在的內毒素，后續可使用pH 10的氫氧化鈉溶液對樣品溶解并稀釋100倍后進行內毒素檢測。

表1 供試品干擾試驗結果Tab.1 Results of the interference test on test samples

2.4 方法的精密度和準確性驗證

采用2.3 項下方法對樣品進行溶解及稀釋，參照2020年版《中國藥典（四部）》通則1143的內毒素檢測方法進行檢測，并進行方法精密度和準確性的驗證。在供試品溶液Ⅲ中加入內毒素標準品適量，制成內毒素標準品的終濃度分別為1.0，0.1，0.01 EU/mL，供試品溶液終質量濃度為0.5 mg/ mL，標準曲線溶液濃度為1.0，0.1，0.01 EU/ mL，并以溶劑作為空白對照，連續定量檢測3 次，計算3 次結果間的變異系數（CV），作為方法精密度的驗證指標，同時計算各孔的回收率，作為方法準確性的驗證指標。結果顯示，含不同濃度內毒素的供試品溶液Ⅲ，平均回收率均在96%～108%之間，表明該方法準確性較好；檢測結果的CV值均小于5%，表明該方法精密度較好。詳見表2。

表2 供試品內毒素含量檢測方法的準確性和精密度Tab.2 Accuracy and precision of the detection method for endotoxin content in test samples

2.5 樣品內毒素含量測定

取3 批樣品，按2.4 項下方法制備標準曲線溶液、0.5 mg/mL 供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液（添加的標準內毒素終濃度為0.1 EU/ mL），另取BET用水作為空白對照；在無內毒素的96 孔板中分別加入上述溶液，以及0.1 mL動態顯色鱟試劑，混勻后以酶標儀檢測，并計算供試品的內毒素含量以及對應的回收率。結果3批樣品均未檢出內毒素，詳見表3。

表3 樣品細菌內毒素含量測定結果（n=3）Tab.3 Results of content determination of bacterial endotoxin in three batches of samples（n=3）

3 討論

注射用多西他賽聚合物膠束，溶解后即是以聚乙二醇單甲醚聚乳酸嵌段共聚物（mPEG - PDLLA）作為多西他賽藥物載體的一種自組裝膠束溶液，具有生物可降解性和較好的生物相容性，現主要用作疏水性藥物的給藥載體［8］。其具有較典型的殼-核結構，親脂性內核可攜帶疏水性藥物，親水性外殼可增加藥物在水溶液中的溶解性，同時可避免藥物進入體內后被吸附或吞噬，延長藥物在體內的作用時間，提高療效［9］。但這種具有兩親性的聚合物載體，在增加難溶性藥物溶解度的同時也增加了內毒素的溶解度，同時還可能將內毒素包裹在膠束中，影響內毒素檢測結果的準確率，導致漏檢或假陰性情況發生［10］。因此，在內毒素檢測前破壞膠束，釋放出藥物及可能含有的內毒素，再進行檢測，則可提高內毒素檢測的準確性。

本研究預試驗結果顯示，氫氧化鈉溶液能加速樣品降解，因此，首先觀察不同pH 的氫氧化鈉溶液對樣品穩定性的影響。激光粒度儀可以通過測量光散射的方法測量溶液中粒子的粒徑，但當光強度（kcps）值過低時，測定的準確度會下降。透射電鏡可直觀地觀察膠束粒子的形態，但由于膠束粒子為有機物，透射電鏡的電子束會在成像的同時破壞膠束粒子，故本研究中采用激光粒度儀的粒徑測量和透射電鏡觀察兩種方法結合，來確認膠束狀態。

本研究中首先根據已有文獻中對類似聚合物膠束穩定性的試驗結果［3-4］，選擇了對后續內毒素檢測干擾相對較小的、以pH10 的氫氧化鈉溶液加速膠束降解進行破壞，結合透射電鏡的形態觀察和激光粒度儀的粒度測定，確定破壞膠束穩定性的條件。結果顯示，樣品加入pH10 的氫氧化鈉溶液稀釋至0.5 mg/mL，膠束的穩定性即被破壞，表現為粒徑變大，且光kcps 值較小，提示膠束丁達爾效應消失，穩定狀態被破壞［11］。考慮到激光粒度儀檢測膠束粒徑主要為儀器更具光散射進行模擬計算得到的結果［12］，因而本研究中還采用透射電鏡對溶液進行觀察，結果顯示，膠束在未破壞時呈現球狀形態，被破壞后，球狀形態消失。但由于膠束粒子主要是由有機物組成，對電子束的耐受能力較弱，長時間聚焦會加速膠束粒子的破壞和形態的改變［13］，故本研究中僅采用了較小的放大倍數。通過粒度測定和透射電鏡的形態觀察的結果可以確認，pH10 的氫氧化鈉溶液可破壞樣品并使其中可能包裹的內毒素能釋放至溶液中。

加入pH10 的堿性溶液破壞聚合物形成膠束的同時，也可能破壞供試品中已經存在的內毒素，為排除其對既有內毒素的影響，本研究中直接在已破壞的樣品中加入一定量的內毒素來模擬樣品中可能存在的內毒素，然后進行膠束的破壞和稀釋，計算檢測供試品溶液中內毒素的加標回收率。結果顯示，終質量濃度為0.5 mg/mL 的供試品溶液（已達MVD）的加標回收率接近100%，說明加入pH10 的氫氧化鈉溶液進行破壞時，不會對供試品溶液中可能存在的內毒素產生明顯的破壞作用。

方法學考察結果顯示，供試品溶液中分別加入不同濃度的內毒素標準品后，回收率均接近100%，符合內毒素定量檢測方法要求（50%～200%）。對樣品重復檢測3 次，結果的CV均不超過5%，滿足內毒素定量檢測方法的要求（一般為不超過10%），表明該方法具有較好的精密度和準確度。將3批樣品稀釋至終質量濃度為0.5 mg/ mL 時檢測，檢查結果均小于限值，符合規定。

綜上所述，本研究中對于注射用多西他賽聚合物膠束這一特殊劑型，建立了破壞膠束后再進行內毒素含量檢測的方法，相對于直接稀釋后進行內毒素檢測，該方法可使聚合物膠束中可能存在的細菌內毒素釋放至溶液中，避免檢測結果的假陰性或遮蔽，提高了檢測結果的準確性和藥品臨床試驗的安全性。同時，本研究中采用堿性溶液加速膠束溶液降解，避免了使用高濃度有機溶劑等膠束破壞方法對后續檢測的影響，可為此類聚合物膠束類藥物內毒素的檢測提供參考。