異甘草酸鎂對酒精性肝損傷模型大鼠的影響*

王丹丹，喬 進，趙 彥

（南通大學附屬南通第三醫院，江蘇 南通 226006）

當前，全球每年約255 萬人由于長期飲酒導致死亡，約20%長期飲酒酗酒人群患有酒精性肝病（ALD），ALD 主要表現為肝臟細胞的損傷、壞死及凋亡［1］。臨床治療ALD 的傳統方案包括使用糖皮質激素或腫瘤壞死因子 - α 抑制劑［2］，由于上述藥物的免疫抑制作用，使用后常會增加感染風險。異甘草酸鎂屬鎂鹽，具有良好的抗炎、抗氧化、抗病毒作用和保肝活性，臨床主要用于治療炎性肝臟疾病［3］，用于治療藥物性肝損傷、免疫介導的肝損傷、脂肪肝時也有肝保護作用［4-6］。有研究顯示，異甘草酸鎂可減少乙醇在體外誘導的脂質積累［7］，但其在體內有效治療ALD 的機制尚未明晰［8］。本研究中探討了異甘草酸鎂對酒精性肝損傷模型大鼠的肝臟保護作用是否與減輕肝細胞氧化應激損傷及抑制中性粒細胞浸潤有關。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：BH - NIC - B 型倒置光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；722 型分光光度計（上海分析儀器廠）；Yil - 16G 型低溫離心機、TDL - 50B 型離心機（上海安亭科學儀器廠）；HH-S2 型恒溫水浴箱（河南金博儀器制造有限公司）。

試藥：異甘草酸鎂注射液（正大天晴藥業集團股份有限公司，批號為200508104）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT，批號為140118010）試劑盒，天門冬氨酸氨基轉移酶（AST，批號為140218007）試劑盒，丙二醛（MDA，批號為20180326）試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD，批號為20180322）試劑盒，髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（批號為20191211），均購自南京建成生物工程研究所；β -actin 抗體（上海康成生物工程有限公司，批號為ab8226）；5-脂氧化酶（5-LO）抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號為760700）；預染蛋白Marke（r美國New England Biolabs公司，批號為00686128）。

動物：清潔級SD 大鼠，10 周齡，雌雄各半，體質量160～180 g，購自南通大學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK（蘇）2018-001，動物使用許可證號SYXK（蘇）2018-0031。飼養期間自由飲水，飼喂普通維持飼料。飼養環境為晝夜各半循環照明，濕度恒定，溫度22～25 ℃。適應性喂養1周后開始實驗。本研究中動物實驗方案經實驗動物倫理委員會批準，符合動物保護原則。

1.2 方法

1.2.1 復制模型與分組、給藥

48只大鼠隨機分為正常對照組（等體積生理鹽水）、模型組（等體積生理鹽水），以及異甘草酸鎂低、高劑量組（15 mg / kg，45 mg / kg），各 12 只。第 1～2 周灌胃50%乙醇（8 mL/ kg），第3～8 周均灌胃50%乙醇（12 mL/kg），復制酒精性肝損傷大鼠模型，同時正常對照組灌胃等體積生理鹽水。復制模型的同時，各組大鼠腹腔注射相應藥物或生理鹽水，每日1次，持續8周。

1.2.2 觀察指標

一般情況：觀察研究過程中各組大鼠的精神狀態、生存情況等。

轉氨酶水平：末次給藥后禁食12 h，麻醉大鼠，腹主動脈取血，常規離心，取上清液，按試劑盒說明書測定大鼠血清中ALT及AST的水平。

MDA 及SOD 水平：末次給藥后禁食12 h，處死大鼠，取肝組織，用生理鹽水漂洗后吸干表面液體，置碎冰塊上的玻璃皿中剪碎、勻漿，低溫離心后取上清液，按試劑盒說明書測定大鼠肝組織勻漿中MDA 及SOD的水平。

肝組織病理形態學：取大鼠肝臟，蘇木素- 伊紅（HE）染色，石蠟切片，脫蠟，染色，在顯微鏡下觀察大鼠肝組織病理形態學。

肝組織MPO 表達水平：采用免疫組化法。將大鼠肝組織切片、脫蠟，梯度乙醇入水，用檸檬酸緩沖液修復抗原，3%過氧化氫溶液滅活，MPO - 抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫，30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，二抗（1∶1 000）37 ℃孵育 30 min，PBS 洗滌 3 次，DAB 顯色，蘇木素復染，透明，封片。采用JEDA801D 型形態學軟件測定陽性信號的面積與平均灰度值。

5-LO蛋白水平：采用Western bloting法。取大鼠肝組織適量，加入RIPA蛋白裂解液，以BCA法測定蛋白含量。SDS-PAGE 電泳后電轉，恒流300 mA 轉膜150 min至PVDF 膜上；用含5%脫脂牛奶的TBST 室溫封閉2 h，分別加入5 - LO 一抗與β - actin 抗體4 ℃搖床孵育過夜；TBST洗滌2次，再加相應二抗室溫反應1 h，TBST洗滌2 次，加入ECL 化學發光試劑，X 線膠片曝光顯影定影。通過Image J軟件將條帶灰度值數字化，計算各目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0 統計學軟件分析。計量資料以表示，行單因素方差分析或q檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

模型組大鼠灌胃乙醇，表現出反抗狀態，灌胃后10 min，精神明顯受到抑制，活動少。異甘草酸鎂低、高劑量組大鼠上述癥狀較模型組顯著減輕，活動增多。模型組大鼠在第6 周與第7 周分別死亡1 只，剩余10 只，異甘草酸鎂低、高劑量組大鼠未見死亡。

2.2 肝組織病理形態學

正常對照組大鼠的肝組織結構排列緊致，肝細胞大小均勻；模型組大鼠肝細胞之間有空泡，排列不齊，較紊亂，部分肝細胞變性壞死；異甘草酸鎂低、高劑量組大鼠肝細胞的變性不同程度改善，炎性細胞浸潤程度較模型組減輕。詳見圖1。

圖1 大鼠肝組織病理形態學（HE，×200）Fig.1 Pathological morphology of liver tissue of rats（HE，× 200）

2.3 實驗室檢測指標

血清轉氨酶：與正常對照組比較，模型組大鼠血清ALT 及AST 水平均顯著升高（P ＜0.01）；與模型組大鼠比較，異甘草酸鎂低、高劑量組大鼠ALT 及AST 水平均顯著降低（P ＜0.05或P ＜0.01）。詳見表1。

肝組織勻漿中MDA 及SOD：與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織勻漿中MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低（P ＜0.01）。與模型組比較，異甘草酸鎂低、高劑量組大鼠MDA 水平均顯著降低，SOD 水平均顯著升高（P ＜0.05或P ＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠血清及肝組織勻漿中檢測指標比較（）Tab.1 Comparison of serum ALT and AST levels of rats in each group（）

表1 各組大鼠血清及肝組織勻漿中檢測指標比較（）Tab.1 Comparison of serum ALT and AST levels of rats in each group（）

注：與正常對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。Note：Compared with those in the normal control group，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；Compared with those in the model group，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01.

組別正常對照組（n=12）模型組（n=10）異甘草酸鎂低劑量組（n=12）異甘草酸鎂高劑量組（n=12）5-LO 0.28±0.02 0.93±0.05*0.48±0.02#0.44±0.03#劑量（mg/kg）15 45 ALT（U/L）39.36±3.47 90.55±7.01**77.14±4.26#58.19±5.03##AST（U/L）85.31±6.95 164.24±12.36**122.77±9.81#93.66±7.12##MDA（nmol/L）2.17±0.14 9.58±0.31**7.04±0.24#4.97±0.22##SOD（U/mL）134.30±9.28 60.11±4.87**90.13±4.42#111.89±5.26##MPO 0.05±0.01 0.78±0.13**0.46±0.06#0.22±0.02##

肝組織勻漿中MPO 表達：正常對照組大鼠肝組織勻漿中MPO的陽性程度弱；與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織勻漿中MPO陽性表達水平顯著升高（P ＜0.01）。與模型組比較，異甘草酸鎂低、高劑量組大鼠肝組織勻漿中MPO陽性表達水平均顯著降低（P ＜0.05或P ＜0.01）。詳見表1及圖2。

圖2 大鼠肝組織勻漿中MPO表達水平（蘇木素，×200）Fig.2 MPO expression levels in liver homogenate of rats（Hematoxylin，× 200）

肝組織勻漿中5 - LO 蛋白表達：與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織勻漿中5 - LO 蛋白表達水平顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較，異甘草酸鎂低、高劑量組大鼠肝組織勻漿中5-LO 蛋白表達水平均顯著降低（P ＜0.05）。詳見表1及圖3。

圖3 大鼠肝組織勻漿中5-LO蛋白表達水平Fig.3 5-LO protein expression levels in liver homogenate of rats

3 討論

本研究中采用乙醇灌胃復制的大鼠肝損傷模型，對大鼠帶來的病理與生理變化符合長期飲酒人群的生理與病理變化規律。該模型中，采用前2 周與后6 周同體積分數但不同劑量的乙醇灌胃，成功復制了大鼠模型。

ALT與AST均是肝損傷的敏感性指標，分別存在于肝臟細胞的細胞漿與線粒體內，當肝臟受到損傷時，兩者均會從細胞內釋放入血［9-11］。本研究中，模型組大鼠血清中ALT 及AST 水平均顯著高于正常對照組，異甘草酸鎂低、高劑量組大鼠血清中ALT 及AST 水平均顯著低于模型組；同時，模型組大鼠肝組織勻漿中MDA水平顯著高于正常對照組，SOD 水平顯著低于對照組，提示大鼠經乙醇灌胃，肝組織處于氧化應激損傷狀態；異甘草酸鎂低、高劑量組肝組織勻漿中MDA 水平較模型組顯著降低，SOD 水平顯著升高，提示異甘草酸鎂能通過降低肝臟氧化應激損傷來減輕乙醇對肝臟的損害。

中性粒細胞浸潤在肝組織病變中發揮了極大的損害作用，進一步加重了肝組織損傷［12-14］。模型大鼠肝臟中，大量浸潤的中性粒細胞會進一步釋放出炎性物質、細胞毒類物質來加重病理性傷害，進一步破壞肝功能，引起肝細胞損傷。MPO 在機體內由中性粒細胞等分泌，是中性粒細胞的標記物，其表達水平的高低可直接反映組織的炎癥程度［15-16］。5-LO 在肝臟中一般參與白三烯、花生四烯酸等的催化反應，介導炎性反應的發生與發展，參與炎性反應的放大過程。有研究發現，5-LO加快了中性粒細胞生成白三烯B4的過程，白三烯B4則導致了炎癥發生［17］。因此本研究中通過藥物干預控制ALD 模型大鼠肝組織中5 - LO 的表達，觀察能否抑制肝臟疾病的發病及進展。

本研究中，異甘草酸鎂低、高劑量組大鼠肝細胞中炎性細胞的浸潤程度較模型組顯著減輕，免疫組化結果顯示，大鼠肝組織勻漿中MPO 陽性表達水平及5 - LO 蛋白表達水平不同程度降低，提示不同劑量的異甘草酸鎂對炎性反應的抑制程度不同。

綜上所述，異甘草酸鎂具有一定的肝臟保護作用，其機制可能與減輕肝細胞氧化應激損傷與抑制中性粒細胞浸潤有關。