枳椇子抗肝纖維化作用網絡藥理學研究*

吾斯曼·艾海提，艾則孜江·艾爾肯

（新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部，新疆 烏魯木齊 830054）

肝纖維化是因肝臟受到長期刺激時，細胞外基質分泌過多沉積導致，是慢性肝炎- 肝纖維化- 肝硬化發展過程中的重要中間環節［1-2］。肝病在我國的發病率呈持續升高趨勢，其中慢性肝炎進展為肝硬化的發生率為2%～10%［3］。目前，有研究發現肝纖維化可逆，但臨床尚無有效的治療藥物與方法［4］。近年來，中醫藥在抗肝纖維中顯示出顯著優勢［5］。枳椇子為鼠李科植物北枳椇Hovenia dulcisThunb. 的干燥成熟種子，始載于《新修本草》，具有止渴除煩、清熱利尿之功效。現代藥理學研究顯示，枳椇子可改善模型大鼠肝纖維化程度［6-7］。其能改善肝功能，下調基質金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP- 1）的表達，進而改善肝臟膠原的降解功能，逆轉肝纖維化［8-9］，但枳椇子抗肝纖維化的有效活性物質及作用機制尚待闡明。因此，本研究中基于網絡藥理學，通過預測分析枳椇子的活性成分及其治療肝纖維化的靶點、信號通路，探討其抗肝纖維化的作用機制，以期為臨床防治肝纖維化提供理論依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點獲取

以枳椇子為關鍵詞輸入中醫藥系統藥理學平臺（TCMSP），設口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，檢索枳椇子的活性成分，并獲取成分靶點，同時借助蛋白質數據庫（Uniprot，https：//www.uniprot.org）標準化處理成分靶點。

1.2 肝纖維化靶點獲取

以“hepatic fibrosis”為關鍵詞，分別輸入GeneCards、人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http：//www.omim.org）及疾病關聯關系數據庫（DisGeNET，https：// www. disgenet.org），檢索肝纖維化的靶點并合并，剔除重復靶點后即得肝纖維化潛在靶點。

1.3 抗肝纖維化靶點獲取及成分-靶點網絡構建

將得到的成分靶點及肝纖維化靶點輸入Venny 平臺，取交集，即得枳椇子抗肝纖維化的潛在靶點。將枳椇子活性成分及枳椇子抗肝纖維化的潛在靶點一一對應導入Cytoscape 3.7.0 軟件中，構建成分-靶點網絡，并借助軟件分析工具對網絡進行拓撲參數分析，節點的節點度（Degree）值越大，代表節點越重要，最后根據Degree值排序篩選靠前的成分為核心成分。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡構建

將枳椇子抗肝纖維化的潛在靶點導入String 數據庫中，設置物種為Homo sapiens，最小交互打分值為0.7，隱藏離散的蛋白，得到PPI 關系。將結果導入Cytoscape 軟件中構建PPI 網絡，并借助軟件分析工具對網絡進行拓撲參數分析，根據Degree 值篩選靠前的靶點為核心靶點。

1.5 潛在靶點富集分析

利用R 語言軟件對枳椇子抗肝纖維化的潛在靶點進行基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，其中GO 富集分析包括生物學過程（BP）、細胞成分（CC）及分子功能（MF）3個部分。根據P值篩選靠前的結果進行繪圖分析。

2 結果

2.1 活性成分及靶點

共得活性成分7 個（見表1），靶點289 個，剔除重復及無標準名靶點后得187個靶點。

表1 枳椇子的活性成分Tab.1 Active components of Hovenia dulcis

2.2 肝纖維化潛在靶點

在 GeneCards，OMIM 及 DisGeNET 數據庫分別檢索得到6 241，28，63 個肝纖維化靶點，剔除重復靶點后再與上述枳椇子活性成分及靶點取交集，得到枳椇子抗肝纖維化的靶點，詳見圖1。

圖1 活性成分-肝纖維化靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of active component-hepatic fibrosis targets

2.3 活性成分-靶點網絡

成分- 靶點網絡包含172 個節點，258 條邊，詳見圖2，圖中紅色為枳椇子活性成分，綠色為其抗肝纖維化潛在靶點。表明山柰酚、柚皮素、槲皮素等6個黃酮類化合物為參與抗纖維化過程的核心成分，其在抗肝纖維化過程中起關鍵作用。

圖2 活性成分-靶點網絡Fig.2 Active component-target network

2.4 PPI 網絡

網絡中包含152 個節點，892 條邊，其中節點越大，藍色越深，代表其Degree 值越大，連線越粗代表蛋白間的相互作用越強，詳見圖3。根據Degree 值得到AKT1，JUN及MAPK3等10個靶點為核心靶點，詳見表2。

圖3 蛋白-蛋白互作網絡圖Fig.3 PPI network

表2 核心靶點信息Tab.2 Information of key targets

2.5 富集分析

GO 功能富集分析結果涉及對金屬離子的應答、對脂多糖的應答、藥物應答、對細菌來源分子的應答、細胞對化學壓力的反應等1 877條BP通路（圖4 A）；膜筏、膜微區、質膜筏、小窩及細胞器外膜等64個CC通路（圖4 B）；核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、DNA 結合轉錄因子結合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子結合及G 蛋白偶聯受體活性等163 條MF 通路（圖4 C）。KEGG 富集分析結果主要涉及腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素17（IL-17）及晚期糖基化終末產物及其受體（AGE-RAGE）等177條通路（圖4 D）。

圖4 富集分析結果Fig.4 Results of the enrichment analysis

3 討論

肝纖維化為慢性疾病，長期刺激可使肝臟結構改變甚至導致肝功能喪失，多種細胞因子及細胞外基質（ECM）在肝纖維的發生發展中至關重要［10］。中醫學中根據肝纖維化的病理特征，將其歸屬于“積聚”“脅痛”等范疇［3］。枳椇子可促進肝星狀細胞（HSC）凋亡，減少ECM 的過量堆積，并減少轉化生長因子-β1（TGF-β1）及TIMP-1的表達，進而阻滯肝纖維化的發展［11］。本研究中通過網絡藥理學分析發現，枳椇子主要通過β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及柚皮素等活性成分發揮療效。β-谷甾醇能下調活化HSC 中膠原-1 和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mRNA 的蛋白表達水平，防止膠原積累，從而治療肝纖維化［12］。山柰酚在體內外均能顯著抑制膠原的合成和HSC 的活化，顯著降低肝組織壞死炎癥的評分，抑制激活素受體樣激酶5 而減輕肝纖維化［13］；其通過降低丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）的活性，減少羥脯氨酸（HYP）的含量及炎性因子水平，進而阻止肝纖維化進展，保護肝組織，這可能與山柰酚抑制β-catenin的表達從而抑制β -catenin/Wnt 通路有關［14-15］。柚皮素可通過阻斷氧化應激、炎性反應以及TGF-β-Smad 3和JNK-Smad 3通路，滅活HSC和抑制促纖維化途徑減輕肝纖維化［16］。此外，柚皮素可通過抑制內質網應激和自噬改善四氯化碳（CCl4）誘導的大鼠肝損傷［17］。

GO 及KEGG 富集分析結果顯示，枳椇子通過對金屬離子、脂多糖、藥物及細菌來源分子的反應等生物學過程，涉及 AKT1、JUN 及 MAPK3 等核心靶點，調控TNF、IL-17 及AGE-RAGE 等通路發揮抗肝纖維化作用。通過下調AKT1 及p - AKT1 的表達，能抑制PI3K/Akt信號通路的活化，進而促進HSC 凋亡起保護肝纖維化作用［18］。c - Jun 是AP1 激活蛋白（AP1）的一個組成部分，其可被PI3K/AKT 信號通路激活，從而參與HSC的活化和肝纖維化［19］。通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Akt信號通路的磷酸化而抑制LPS 誘導的炎性反應，進而保護大鼠免受肝軸異常引起的肝纖維化［20］。此外，通過下調MAPK，P-MAPK，P38 的蛋白表達水平，抑制MAPK 信號通路，可顯著改善CCl4誘導的纖維化［21］。TNF 為一種免疫細胞因子，參與機體免疫功能的調節。通過降低TNF- α 和IL-1β 的表達水平，能抑制HSC 增殖及活化，減少ECM 的生成，增加其降解，進而改善肝纖維化［22］。IL-17作為炎性細胞因子，在各種肝臟疾病中起重要作用，可調節HSC 的活化和肝纖維化進展。3型細胞因子IL-17及IL-22可增強p38絲裂原激活蛋白激酶依賴的TGF-β 信號通路，進而參與肝纖維化［23］。晚期糖基化終末產物（AGE）受體（RAGE）阻斷抗體及可溶性RAGE，可抑制AGE-RAGE 信號通路。RAGE 可降低AGE 誘導的HSC 的自噬和活化，進而促進丙型肝炎相關肝纖維化的形成，提示阻斷AGE -RAGE 信號可緩解肝纖維化［24］。本研究中網絡藥理學預測結果與目前相關研究結果一致，提示枳椇子通過AKT1，JUN，MAPK3 調控TNF，IL - 17，AGE - RAGE 信號通路發揮抗肝纖維化作用。

綜上所述，枳椇子抗肝纖維化是通過β- 谷甾醇、山柰酚、槲皮素及柚皮素等活性成分作用于AKT1，JUN及MAPK3等核心靶點，調控TNF，IL-17，AGE-RAGE信號通路參與到抗肝纖維化進程中。