UPLC-MS/MS直接進(jìn)樣法測定茶飲料中的吡蟲啉和樂果殘留

呂志強(qiáng)，周文禮

許昌市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，河南 許昌 461000

“開門七件事，柴米油鹽醬醋茶”，茶既是大雅之堂的殿上貢品，亦是尋常百姓的餐桌飲品。然而，茶作為一種農(nóng)產(chǎn)品，在種植過程中為防治蟲害，提高產(chǎn)量，不免使用多種農(nóng)藥；同時(shí)，頗受消費(fèi)者青睞的茶飲料作為茶葉的深加工產(chǎn)品，一般以茶葉的水提取液、濃縮液或茶粉為原料加工而成，因此，農(nóng)藥殘留是一個(gè)不可避免的問題。殘留的農(nóng)藥通過食物鏈的富集作用轉(zhuǎn)移到人體，對(duì)人體健康造成危害，因此，研究建立茶飲料中農(nóng)藥殘留的檢測方法十分必要。

農(nóng)殘的檢測方法主要有氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GCMS/MS） 和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）。GC-MS/MS 因分離效果好，對(duì)組分復(fù)雜的樣品能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離，因此廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘檢測領(lǐng)域，但其對(duì)樣品前處理要求較高，分析時(shí)間較長，效率低；而LC-MS/MS 具有靈敏度高，專屬性強(qiáng)，高通量，效率高，在分離不完全的狀態(tài)下也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的定性定量等特點(diǎn)。目前，應(yīng)用LC-MS/MS 測定茶飲料中農(nóng)殘的研究鮮有報(bào)道，而對(duì)茶葉中農(nóng)殘的研究有較多文獻(xiàn)報(bào)道，且其前處理方法為固相萃取法、液-液萃取法和QuEChERs 法等，這些前處理方法使用了多種有機(jī)試劑，成本高、耗時(shí)長、操作繁瑣。因吡蟲啉和樂果為茶園中比較常用的農(nóng)藥，在茶湯中的浸出率也較高，分別可達(dá)77.3%和80.5%，故本研究以吡蟲啉和樂果為分析目標(biāo)物，旨在運(yùn)用UPLC-MS/MS，并嘗試將樣品過濾后直接進(jìn)樣檢測，研究建立一種便捷、準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的適用于茶飲料中吡蟲啉和樂果殘留的檢測方法，以期為茶飲料的質(zhì)量安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

UPLC-MS/MS（美國，Waters，UPLC-Xevo TQD)；UPT-I-510T超純水機(jī)（成都優(yōu)普）；NGM-2000A氮?dú)獍l(fā)生器（北京，LAB PRECITION）。

1.2 試劑與材料

甲醇（德國AppliChem，色譜純)；乙腈（德國AppliChem，色譜純)；甲酸（天津科密歐，色譜純）；超純水（由UPT-I-510T 超純水機(jī)制備）；高純氬氣（純度≥99.999%）；微孔濾膜（尼龍，0.22μm）；吡蟲啉、樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液（壇墨質(zhì)檢，質(zhì)量濃度均為100μg/mL）；經(jīng)檢測不含樂果、吡蟲啉的市售綠茶飲料（GT樣）、紅茶飲料（BT樣）。

1.3 試驗(yàn)方法

精密量取吡蟲啉、樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL置100 mL容量瓶中，加乙腈稀釋定容，搖勻即得質(zhì)量濃度為1 000μg/L混標(biāo)I，分別用GT樣和BT樣將混標(biāo)I逐級(jí)稀釋得到質(zhì)量濃度分別為2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

質(zhì)譜調(diào)諧液：用純乙腈將混標(biāo)I 稀釋至100 μg/L。

稀釋劑考察樣品：分別用超純水、10%乙腈、50%乙腈、乙腈、GT樣和BT樣將混標(biāo)I稀釋至50μg/L。

直接進(jìn)樣法可行性考察樣品：用BT樣將混標(biāo)I 稀釋至100μg/L（BT 樣#）；再用乙腈將BT 樣#分別稀釋至10μg/L、20μg/L、50μg/L。

基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)樣品：分別用10%乙腈、GT 樣和BT 樣將混標(biāo)I 分別稀釋至5 μg/L、50 μg/L、200μg/L。

方法檢出限（MDL）和方法定量限（MQL）樣品：分別用GT 樣和BT 樣將混標(biāo)I 逐級(jí)稀釋，具體稀釋倍數(shù)根據(jù)信噪比（S/N）確定，以S/N≥3時(shí)的質(zhì)量濃度作為MDL，以S/N≥10 時(shí)的質(zhì)量濃度作為MQL。

加標(biāo)回收率樣品：分別用GT 樣和BT 樣將混標(biāo)I 分別稀釋至10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度水平設(shè)3個(gè)平行樣。

流動(dòng)相：A 為含0.1%甲酸的超純水，B 為乙腈，梯度洗脫程序：0～1.5 min，70.0%A；1.5～3.5 min，10.0%A；3.5～4.5 min，10.0%A；4.5～4.6 min，70.0%A；4.6～6.0 min，70.0%A；流速0.250 mL/min；柱溫35.0 ℃；色譜柱：UHPAQ C（Agela Technologies，2.1 mm×100.0 mm，1.9 μm）；進(jìn)樣量：5.00 μL。

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣氮?dú)饬魉伲? 000 L/h；碰撞氣為氬氣；目標(biāo)分析物的其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

將上述樣品經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后直接導(dǎo)入U(xiǎn)PLC-MS/MS 測定，由MssLynx 工作站軟件分析數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中各農(nóng)殘的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

吸取1.3.2 項(xiàng)下的質(zhì)譜調(diào)諧液適量，在combined 模式下與流動(dòng)相（A∶B=50∶50，流速0.200 mL/min）混合后注入質(zhì)譜儀，通過調(diào)整毛細(xì)管電壓、錐孔電壓找到母離子，運(yùn)用Intellistart自動(dòng)優(yōu)化功能，得到最優(yōu)的錐孔電壓和碰撞能，確定定性離子對(duì)和定量離子對(duì)（表1）。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 稀釋劑的選擇

研究發(fā)現(xiàn)，稀釋劑對(duì)目標(biāo)分析物的峰型和分離度影響較大。當(dāng)稀釋劑為乙腈時(shí)，吡蟲啉和樂果未能有效分離且不成峰，當(dāng)提高稀釋劑中水相的比例時(shí)，其峰型不僅變得尖銳，對(duì)稱性良好，且分離度也有了很大改善。因此，本研究分別以乙腈、50%乙腈、10%乙腈、超純水、BT樣和GT樣為稀釋劑制備50μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以10%乙腈、純水、GT 樣和BT 樣為稀釋劑時(shí)，均可得到較為滿意的結(jié)果（圖1）。

圖1 6種稀釋劑制備的50μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的總離子流圖

2.3 色譜條件的優(yōu)化

以0.1%甲酸為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B 梯度洗脫，考察了3 種色譜柱（ACQUITY UPLCBEH C，1.7 μm，2.1×50 mm；ACQUITY UPLCBEH C，1.7 μm，2.1×100.0 mm；UHP AQ C，1.9 μm，2.1 mm×100.0 mm），不同流動(dòng)相初始比例（A∶B=90∶10；A∶B=80∶20；A∶B=70∶30；A∶B=50∶50）和不同流速（0.200 mL/min、0.250 mL/min、0.300 mL/min）對(duì)分析結(jié)果的影響。通過多次反復(fù)試驗(yàn)，最終確定色譜柱UHP AQ C，1.9 μm，2.1 mm×100.0 mm的適用性最優(yōu)，流速為0.250 mL/min，流動(dòng)相初始比例為A∶B=70∶30，在此色譜條件下系統(tǒng)壓力適中。由圖2可知，目標(biāo)分析物的峰型尖銳，分離度較好，保留時(shí)間適中，吡蟲啉和樂果保留時(shí)間分別為2.03 min和2.25 min。

圖2 100μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的總離子流圖

2.4 直接進(jìn)樣法可行性試驗(yàn)

目前，未見有文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)用UPLC-MS/MS 直接進(jìn)樣法測定茶飲料中的吡蟲啉和樂果，為驗(yàn)證該方法的可行性，本研究將1.3.2 項(xiàng)下的直接進(jìn)樣法可行性考察樣品經(jīng)0.22μm濾膜過濾后直接進(jìn)樣測定，以目標(biāo)分析物檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度為評(píng)判依據(jù)，結(jié)果見表2。由測定結(jié)果可知，茶飲料樣品經(jīng)濾膜過濾后稀釋不同倍數(shù)直接進(jìn)樣所測結(jié)果的準(zhǔn)確度在95.5%～107.0%之間，故直接進(jìn)樣法是可行的。

表2 直接進(jìn)樣法測定結(jié)果

2.5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)[28-29]

因茶湯本身基質(zhì)復(fù)雜，含有多種色素、茶多酚、咖啡堿、有機(jī)酸等物質(zhì)，且茶飲料中會(huì)添加糖、食用香精等成分，這些成分是否影響目標(biāo)分析物的離子響應(yīng)強(qiáng)度及分析方法的準(zhǔn)確性還是未知，因此，本研究考察了吡蟲啉和樂果3個(gè)質(zhì)量濃度水平在GT和BT兩種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)。以絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)（AME）為評(píng)判依據(jù)，計(jì)算公式如下：

式中：為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積；為溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積；當(dāng)|AME-1|≤20%時(shí)，判定該基質(zhì)無基質(zhì)效應(yīng)；若20%＜|AME-1|＜50%，則為中等基質(zhì)效應(yīng)；|AME-1|≥50%，則為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。由表3可知，吡蟲啉在BT 基質(zhì)中有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，而在GT 基質(zhì)中無基質(zhì)效應(yīng)；樂果在GT 和BT 基質(zhì)中均無基質(zhì)效應(yīng)。為消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，在配置標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液時(shí)統(tǒng)一選擇空白的GT樣和BT樣為稀釋劑。

表3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 線性范圍、MDL、MQL

按照1.3.1 項(xiàng)下的方法制備系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以各目標(biāo)分析物的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，考察其線性關(guān)系，以S/N≥3 和10 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為MDL 和MQL，結(jié)果見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

兩種基質(zhì)下吡蟲啉和樂果在2～500μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R為0.996 5～0.999 5，MDL為0.010 0～0.033 3μg/L，MQL為0.020 0～0.100 0μg/L，表明該方法可滿足檢測需求。

2.7 方法精密度

將質(zhì)量濃度為50μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)測定6 次，計(jì)算檢測結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表5可見，兩種基質(zhì)下吡蟲啉和樂果測定值的RSD在0.937%～2.020%之間，表明該方法精密度良好。

表5 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.8 方法準(zhǔn)確度

將1.3.4項(xiàng)下制備好的加標(biāo)回收率樣品過0.22μm濾膜后直接進(jìn)樣測定，每個(gè)質(zhì)量濃度水平設(shè)3個(gè)平行樣，計(jì)算平均回收率及RSD。由表6可知，2種基質(zhì)3個(gè)添加水平下吡蟲啉和樂果的平均加標(biāo)回收率在93.3%～111.0%之間，RSD 在0.564%～6.190%之間，可滿足分析要求。

表6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究嘗試采用將茶飲料經(jīng)0.22μm濾膜過濾后直接進(jìn)樣檢測的前處理方法，結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)，建立了茶飲料中吡蟲啉和樂果快速、準(zhǔn)確的檢測方法，這在現(xiàn)有文獻(xiàn)中還未見報(bào)道。通過評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)確定以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法定量，并對(duì)質(zhì)譜條件、液相色譜條件、稀釋劑等進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，在綠茶和紅茶兩種基質(zhì)中，吡蟲啉和樂果在2～500μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R為0.996 5～0.999 5；MDL為0.010 0～0.033 3μg/L，MQL為0.020 0～0.100 0μg/L；方法精密度良好，RSD （n=6） 在0.937%～2.020%之間；3個(gè)質(zhì)量濃度添加水平下吡蟲啉和樂果的平均加標(biāo)回收率在93.3%～111.0%之間，RSD（n=3）在0.564%～6.190%之間，能夠滿足農(nóng)殘檢測的要求。與現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比較，該方法避免使用多種有機(jī)試劑，成本低、簡便高效、精密度好、準(zhǔn)確度高，適用于茶飲料中吡蟲啉和樂果殘留的定性定量分析，為茶飲料的質(zhì)量安全評(píng)價(jià)提供了新的參考。