一起仔豬腹瀉病的病原學診斷

沈思思

（黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

仔豬腹瀉是仔豬常見疾病，病因復雜，可由細菌病和病毒病引起[1]。細菌病主要包括大腸桿菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌等；病毒病主要包括豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）、豬δ冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）和豬輪狀病毒（Porcine rotavirus, PoRV）等。這些疾病臨床癥狀相似，需結合實驗室診斷才能確診[2]。

近期齊齊哈爾市某豬場送檢3只病死仔豬。該豬場存欄量為850頭，此前免疫過豬瘟疫苗、豬呼吸與繁殖障礙疫苗、豬偽狂犬疫苗和豬細小病毒疫苗。此次仔豬腹瀉發病豬為5～9日齡，臨床癥狀表現為精神不振、食欲減退、迅速消瘦、排黃綠色稀便并伴有嘔吐現象。該疾病在豬場迅速蔓延，仔豬發病率為95 %，死亡率達到30 %。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病理剖檢及病料采集 對3只病死仔豬進行剖檢并采集20份發病仔豬肛拭子。

1.1.2 主要試劑與儀器 DNA、RNA試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；cDNA反轉錄試劑盒、DNA MarkerⅡ、Taq酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；離心機（TGL-16G）購自上海安亭科學儀器廠產品；PCR儀（S1000）購自美國伯樂公司；凝膠成像儀（WD-9413B）購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養 在無菌條件下，用接種環在腸道壁少量蘸取，在麥康凱培養基上劃線接種，37 ℃ 培養箱過夜培養。

1.2.2 鏡檢 將長出的單個菌落進行劃線傳代，37 ℃ 培養箱過夜培養。將傳代后的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 DNA提取 將鏡檢過的同一單個菌落用DNA試劑盒提取DNA。

1.2.4 黏附素毒力基因檢測 根據參考文獻[3]，合成相關的毒力基因進行PCR擴增，毒力基因引物序列如表1。

1.2.5 病毒性診斷方法 （1）病料處理及RNA提取：將采集的20份肛拭子用PDS處理后，4 000 r離心5 min取上清。將上清液用RNA提取試劑盒提取RNA。（2）cDNA合成及PCR擴增：用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。根據參考文獻[4-5]，用PEDV、TGEV、PDCoV和GARV引物分別對20份備檢樣本進行PCR擴增，引物序列見表2。反應體系：cDNA 2.0 μl，2×Taq PCR Master Mix12.5 μl，上、下游引物1.0 μl，ddH2O 8.5 μl，總體積25 μl。PCR擴增條件：95 ℃ 30 s、55 ℃ 30s，72 ℃ 40s，循環30次，72 ℃ 10 min。取擴增產物5 μl在1 % 瓊脂糖凝膠板上點樣，電泳15 min，凝膠成像儀上觀察結果。送生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.6 藥敏試驗 根據CLSI指導進行，將細菌培養到1.5× 108CFU/ml，用接種環均勻劃線在培養基上，將藥敏片按順序放置在平板上，37 ℃培養箱過夜培養。

2 結果

2.1 剖檢結果

3只病死仔豬剖檢均表現為腸壁薄而透明，腸腔內積聚黃色液體和氣體，腸壁有出血并伴有水腫現象，胃里有未消化的凝乳塊，見圖1。

圖1 仔豬剖檢

2.2 細菌學診斷結果

麥康凱培養基上長出粉紅色小菌落，純化后，顯微鏡下觀察看到革蘭氏陰性短小桿菌，散在分布，可以確定為大腸桿菌，見圖2。毒力基因結果發現，該細菌是K99毒力基因，為產腸毒素大腸桿菌（ETEC）。20份樣本中檢出15份大腸桿菌陽性，見圖3。

圖2 大腸桿菌鏡檢圖

圖3 大腸桿菌K99 PCR擴增圖

2.3 病毒學診斷結果

PCR結果見圖4，20份樣本中只檢出PEDV陽性樣本12份。TGEV、PDCoV和PoRV均為陰性。PEDV與Bank登錄序列AF353511同源性為99 %。

圖4 PEDV PCR擴增圖

2.4 藥敏試驗結果

藥敏結果顯示該株細菌對環丙沙星和丁胺卡那敏感，對林可霉素、氨芐西林、頭孢唑林、土霉素、慶大霉素、四環素和青霉素耐藥。

3 討論

PEDV造成的仔豬腹瀉與TGEV、PDCoV和PoRV臨床癥狀和病理剖檢相似，如需確認需結合PCR檢測。PEDV會造成機體免疫力下降，從而易感染大腸桿菌。大腸桿菌是腸道正常菌群之一，但是在特定條件下可以致病，本試驗通過細菌分離培養和染色鏡檢診斷為大腸桿菌，結合毒力基因檢測確定其為K99產腸毒素大腸桿菌，對機體有致病性。該豬場是PEDV和產腸毒素大腸桿菌的混合感染，導致仔豬大量死亡，造成了巨大的經濟損失。

PEDV應以預防為主，按時接種疫苗。為防止進一步的疾病擴散，應對豬舍進行徹底的清潔消毒，PEDV和大腸桿菌一般會隨著豬的排泄物排出，污染飼料和水源等，還會通過氣溶膠傳播，所以應將污染物及時焚毀，并將患病豬進行隔離，控制好傳染源，是阻止疾病傳播的第一步。仔豬腹瀉易發生在寒冷季節，因此也要做好豬舍的保暖工作。

4 結論

該豬場病毒與細菌的PCR檢測結果表明該豬場由PEDV和致病性K99產腸毒素大腸桿菌混合感染所致。20份肛拭子檢測結果為PEDV樣本總陽性率為12/20，大腸桿菌樣本總陽性率為15/20，其中PEDV與大腸桿菌混合感染陽性率為12/15，TGEV、PDCoV和PoRV未檢出。藥敏結果顯示該菌株對環丙沙星和丁胺卡那敏感。經環丙沙星治療，病情得到初步控制。