茯苓多糖對(duì)大鼠免疫功能的影響

王 萍，王玉堃，王尚明，于天明，尹貽奎，李梁梁，王玉霞，許方方，譚慶強(qiáng)，李鳳華

（山東迅達(dá)康獸藥有限公司，山東 濟(jì)南 250300）

茯苓是多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poria cocos（Schw．）Wolf的干燥菌核，具有健脾寧心、利水滲濕等功效[1]。茯苓中含有三萜類、甾醇類、多糖類等多種化學(xué)成分，其中多糖類為茯苓的主要活性成分之一[2]。茯苓多糖具有免疫調(diào)節(jié)[3,4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6]及抗氧化[7]等藥理作用。本研究用環(huán)磷酰胺制備免疫低下大鼠模型，以茯苓多糖給藥，通過考察其對(duì)免疫低下模型中大鼠免疫功能的影響，研究茯苓多糖對(duì)大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茯苓多糖 茯苓多糖由山東迅達(dá)康獸藥有限公司提供。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重200±20 g，購于濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)SCXK（魯）20190003。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠免疫球蛋白G（IgG）ELISA試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素2（IL-2）ELISA試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒和大鼠γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司；鹽酸左旋咪唑、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液購自Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自Hyclong公司；酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱均購自上海精密儀器儀表公司；倒置熒光顯微鏡購自上海蔡康光學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茯苓多糖體外免疫活性試驗(yàn) （1）巨噬細(xì)胞增殖試驗(yàn)：制備大鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液[8]，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞生存率大于90 %，用RPMI1640完全培養(yǎng)基（含1 % 青霉素、鏈霉素雙抗與10 % 胎牛血清）調(diào)整懸液細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)每孔接種100 μl該懸液細(xì)胞，取100 μl茯苓多糖加入至上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，使多糖最終濃度為1 000、500、250、125、62.5 μg·ml-1。同時(shí)空白對(duì)照組加等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)孔，取平均值。在37.0 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h，采用MTT法檢測(cè)570 nm處吸光度。（2）脾臟細(xì)胞增殖試驗(yàn)：剝離多余脂肪，放在200目篩上一邊研磨一邊用PBS沖洗，過濾，收集研磨液并離心（4 ℃、3 500 r/min，30 min），將所得沉淀用PBS漂洗3次后得到大鼠脾臟細(xì)胞[9]。再用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1.0×106個(gè)/ml，96孔板內(nèi)每孔接種100 μl該懸液細(xì)胞。取茯苓多糖在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)由1 mg/ml依次2倍稀釋至62.5 μg/ml，同時(shí)空白對(duì)照組加100 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)孔，取平均值。然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及OD值測(cè)定。1.2.2 茯苓多糖體內(nèi)免疫活性試驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，取60只大鼠，隨機(jī)分為6組，每組10只，6組分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、免疫對(duì)照組（鹽酸左旋咪唑100 mg·kg-1）、茯苓多糖低劑量組（100 mg·kg-1）、茯苓多糖中劑量組（200 mg·kg-1）、茯苓多糖高劑量組（400 mg·kg-1）。空白對(duì)照組注射生理鹽水，其余各組腹腔注射80 mg·kg-1的環(huán)磷酰胺，1次/d，連續(xù)3 d，建立免疫低下模型[10]。各組連續(xù)給藥7 d，末次給藥24 h后，大鼠心臟采血并靜置30 min，4 ℃、3 500 r/min離心30 min，取上清液，用ELISA法測(cè)定血清中IgG抗體及細(xì)胞因子（IL-2、IL-6和IFN-γ）含量。采血完成后脫頸椎處死大鼠，摘取完整脾臟和胸腺，剔除筋膜及脂肪組織，用濾紙片吸干臟器的表面血污，并分別稱定質(zhì)量，計(jì)算脾臟及胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)（%）=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100 %；胸腺指數(shù)（%）=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100 %。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓多糖對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞增殖的影響

如表 1所示，茯苓多糖濃度為 62.5～1 000 μg·ml-1時(shí)淋巴細(xì)胞的OD值均大于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明在此濃度區(qū)間內(nèi)茯苓多糖對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞的增殖具有刺激作用，且呈劑量依賴性。濃度為1000 μg·ml-1時(shí)OD值最大，說明在62.5～1 000 μg·ml-1濃度范圍內(nèi)此濃度的茯苓多糖對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞增值的刺激作用最大。

表1 不同劑量茯苓多糖大鼠巨噬細(xì)胞增值的檢測(cè)結(jié)果

2.2 茯苓多糖對(duì)大鼠脾臟細(xì)胞增殖的影響

茯苓多糖對(duì)大鼠脾臟細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表2，從表2可以看出，茯苓多糖濃度在62.5～1 000 μg·ml-1時(shí)吸光度均大于空白對(duì)照組，吸光度隨著濃度的增大而增大，見表2。茯苓多糖濃度為250 μg·ml-1、500 μg·ml-1、1 000 μg·ml-1時(shí)對(duì)脾臟細(xì)胞的刺激作用比較明顯（P＜0.05）。濃度為62.5 μg·ml-1、125 μg·ml-1時(shí)吸光度雖較空白對(duì)照組相比增加，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。總體結(jié)果說明，茯苓多糖能刺激大鼠脾臟細(xì)胞的增殖。

表2 不同劑量茯苓多糖對(duì)大鼠脾臟細(xì)胞增殖結(jié)果

2.3 茯苓多糖對(duì)大鼠血清IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ的影響

如表3所示，模型組大鼠血清IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ含量低于空白對(duì)照組，說明建模成功（P＜0.01）。與模型組相比，免疫對(duì)照組、茯苓多糖高、中、低劑量組測(cè)得IgG抗體及細(xì)胞因子含量均高于模型組，低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。說明多糖可以促進(jìn)免疫低下雞血清中IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ含量。

表3 大鼠血清IL-2、IL-6、IgG、IFN-γ含量的檢測(cè)

2.4 茯苓多糖對(duì)大鼠免疫器官指數(shù)的影響

模型組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)低于空白對(duì)照組，差異極顯著（P＜0.01）。免疫對(duì)照組、茯苓多糖高、中、低劑量組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于模型組，差異比較顯著（P＜0.05）。茯苓多糖組中，中劑量組恢復(fù)胸腺指數(shù)效果較好；高劑量組恢復(fù)脾臟指數(shù)效果較好，見表4。

表4 各組免疫器官指數(shù)的變化

3 討論

茯苓多糖是茯苓的主要藥用活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等作用[11]。其中免疫調(diào)節(jié)活性是中藥多糖研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。茯苓多糖在體液免疫、細(xì)胞免疫及黏膜免疫方面均有顯著的修復(fù)或增強(qiáng)作用[12]。胸腺和脾臟分別作為體內(nèi)中樞和外周的主要免疫器官，在維持機(jī)體正常免疫功能方面發(fā)揮重要作用。正常的胸腺功能是確保機(jī)體成熟T細(xì)胞數(shù)量的基礎(chǔ)[13]。脾臟則是具有免疫活性的T、B細(xì)胞移居和受到抗原刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所，而且可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能[14]。因此，免疫器官的發(fā)育情況與機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱密切相關(guān)。脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的降低可顯示免疫功能的降低。本試驗(yàn)檢測(cè)了各組大鼠免疫器官指數(shù)，結(jié)果顯示茯苓多糖能提高免疫抑制大鼠免疫器官發(fā)育，提高免疫功能。巨噬細(xì)胞在宿主防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是非特異性免疫的主要參與者[15]，脾臟是重要的免疫器官，兩者的細(xì)胞數(shù)量能一定程度上反映機(jī)體的免疫應(yīng)答能力和水平[16-17]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，茯苓多糖對(duì)淋巴細(xì)胞、脾臟細(xì)胞的增殖具有刺激作用，濃度越高，刺激作用越強(qiáng)。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，是介導(dǎo)體液免疫的主要的免疫球蛋白，同時(shí)也是血清學(xué)診斷檢測(cè)的主要免疫球蛋白[18]；細(xì)胞因子IL-2可促進(jìn)淋巴細(xì)胞生長、增殖、分化；IL-6誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖分化；IFNγ具有促進(jìn)抗原呈遞、提高NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和溶酶體活性的作用[19]。因此，通過對(duì)IgG、IL-2、IL-6和IFN-γ水平的檢測(cè)，可以反映出機(jī)體的免疫狀況。本試驗(yàn)結(jié)果表明，茯苓多糖可通過提高大鼠血清中IgG、IL-2、IL-6和IFN-γ含量，進(jìn)而提高大鼠免疫力。

4 結(jié)論

茯苓多糖主要通過刺激巨噬細(xì)胞、脾臟細(xì)胞增殖，促進(jìn)IgG抗體及IL-2、IL-6、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，增加免疫器官指數(shù)，從而提高了SD雄性大鼠的免疫力。