血管生成因子VEGF及sflt-1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義

鄭萍萍，王小紅

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 福州 350004）

0 引言

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMT）是臨床常見的婦科疾病，指在子宮體以外的部位出現(xiàn)了子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）的種植生長，以進(jìn)行性加重的痛經(jīng)、月經(jīng)異常、不孕及性交不適為主要癥狀，對婦女的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[1]。育齡期是EMT的高發(fā)時段，近年來發(fā)病率呈持續(xù)上升的狀態(tài)。對于EMT的現(xiàn)代學(xué)發(fā)病機制，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可和支持Sampson提出的經(jīng)血逆流種植學(xué)說。同時，郎景和提出的發(fā)病三部曲“AAA模式”，要完成黏附（Attachment）-侵襲（Aggression）-血管形成（Angiogenesis），內(nèi)膜細(xì)胞必須通過腹水、腹腔細(xì)胞和腹膜細(xì)胞外基質(zhì)的3道防線，是對經(jīng)血逆流種植學(xué)說的分子生物學(xué)機制的補充和完善[2]。血管生成在該發(fā)病模式中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究顯示，血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）及 其 受 體VEGFR（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor）是一組已知擁有最強促進(jìn)血管生成作用及對內(nèi)皮細(xì)胞最高特異性的血管生成信號通路，可以促進(jìn)血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞增生[3,4]。血管內(nèi)皮生長因子可溶性受體（Soluble fms-like tyrosine kinase-1，sflt-1）為VEGF的 受體之一，與VEGF具有高度的親和力。

目前腹腔鏡下見到異位病灶和病灶組織的病理活檢是本病診斷的依據(jù)，但是，活檢組織的病理報告陰性，并不能成為異位病灶的診斷的排除條件。對于EMT，如今還缺乏高敏感度的臨床檢測方法，也缺乏特異性的無創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)志物。本課題通過檢測血管生成因子VEGF及其受體sflt-1在兩組患者中的水平，分析其在兩組中表達(dá)的差異；探究血管生成因子VEGF及其可溶性受體sflt-1在EMT中的表達(dá)及意義，以尋找無創(chuàng)的生物學(xué)檢測方法，為疾病的早期診治及疾病的預(yù)防和隨訪提供有效的簡易方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年1月至2021年1月期間，在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院婦科病房住院的患者，其中行腹腔鏡手術(shù)，術(shù)后病理確診EMT的患者60例（實驗組）；行腹腔鏡切除子宮，術(shù)后病理診斷排除EMT及子宮腺肌病患者60例(對照組)；共120例。兩組的年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組具有可比性。見表1。

表1 兩組患者的年齡情況比較（±s）

組別 例數(shù) 最小年齡（歲） 最大年齡（歲） 平均年齡（歲) Z值 P值對照組 60 36 50 42.22±2.731 -1.621 0.105實驗組 60 34 51 41.43±4.496

1.1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照第9版婦產(chǎn)科學(xué)[1]及2015年子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南[5]。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

均經(jīng)術(shù)后病理確診；月經(jīng)規(guī)律，且術(shù)前3個月內(nèi)未使用激素類藥物治療者；同意參加本次實驗研究并簽署知情同意書。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；術(shù)前3個月使用激素類藥物治療者；子宮內(nèi)膜病變、惡性腫瘤及癌前病變患者；近期有燒傷、燙傷、挫傷等皮膚大面積損傷，可能影響實驗結(jié)果的病史者。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的采集及保存

血清：兩組患者，于術(shù)前月經(jīng)干凈后2-3天的清晨，空腹抽取5mL靜脈血（肘部），常溫下靜置1h，轉(zhuǎn)速3000 r/min下離心20min，將上清液置于凍存管中，并保存在-80℃的條件下待檢，避免反復(fù)凍融。內(nèi)膜組織：實驗組為腹腔鏡術(shù)中取異位內(nèi)膜組織(異位內(nèi)膜囊腫壁組織)，對照組為子宮切除術(shù)后取子宮內(nèi)膜組織，組織置于有RNA保護(hù)液的凍存管中，-80℃的條件下保存待檢，避免反復(fù)凍融。

1.2.2 檢測方法

（1）ELISA方法檢測血清中VEGF及sflt-1的水平

采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)試劑盒（MM-0115H1，酶免）和人可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1(sflt-1)試劑盒（MM-1900H1，酶免），采用全自動酶標(biāo)儀（WD-2102B，六一）進(jìn)行檢測，實驗檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，通過檢測得到OD值和標(biāo)準(zhǔn)物的濃度，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式得出樣品濃度。

（2）Real-time PCR方法檢測內(nèi)膜組織中VEGF mRNA及sflt-1 mRNA的表達(dá)

采用超純RNA提取試劑盒（CW0581M，CWBIO，康為世紀(jì)）對內(nèi)膜組織中的mRNA進(jìn)行提取，用紫外分光光度儀對RNA濃度、純度進(jìn)行測定，用5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用2×SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行擴(kuò)增，采用CFX Connect?實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)和熒光定量；繪制出熔解曲線和擴(kuò)增曲線，運用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.2.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料以（±s）表示，兩組計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布兩組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布兩組間比較采用秩和檢驗；多組計量資料采用單因素方差分析；計數(shù)資料采用卡方檢驗；兩變量相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、sflt-1在兩組患者術(shù)前血清中的表達(dá)

兩組患者術(shù)前血清中VEGF水平經(jīng)非參數(shù)檢驗，結(jié)果顯示兩組有差異，實驗組患者血清中VEGF水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；兩組患者術(shù)前血清中sflt-1水平經(jīng)獨立樣本t’檢驗，結(jié)果顯示兩組有差異，實驗組患者血清中sflt-1水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05，見表2。

表2 兩組患者術(shù)前血清中VEGF及sflt-1表達(dá)情況 比較(±s)

表2 兩組患者術(shù)前血清中VEGF及sflt-1表達(dá)情況 比較(±s)

組別 例數(shù) VEGF（pg/mL） sflt-1（pg/mL）實驗組 60 94.74±19.976 1401.29±272.31對照組 60 52.17±12.507 784.38±92.198 P值 ＜0.05 ＜0.05

2.2 VEGF mRNA、sflt-1 mRNA在兩組患者內(nèi)膜組織中的表達(dá)

兩組患者內(nèi)膜中VEGF mRNA及兩組內(nèi)膜中sflt-1 mRNA的相對表達(dá)量分別經(jīng)非參數(shù)檢驗，結(jié)果均顯示兩組有差異，實驗組異位內(nèi)膜組織中VEGF mRNA及sflt-1 mRNA的表達(dá)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05，見表3。

表3 兩組患者內(nèi)膜組織中VEGFmRNA及sflt-1 mRNA的表達(dá)情況比較（±s）

表3 兩組患者內(nèi)膜組織中VEGFmRNA及sflt-1 mRNA的表達(dá)情況比較（±s）

組別 例數(shù) VEGF mRNA sflt-1 mRNA實驗組 60 3.08±1.554 1.50±0.719對照組 60 1.35±1.157 1.12±0.507 Z值 6.477 2.520 P值 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

EMT雖然有著良性的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，但又有著類似惡性腫瘤的侵襲、種植及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等發(fā)病特點，血管生成在為腫瘤的發(fā)展提供氧氣和營養(yǎng)以及為腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移提供通道中，都有著重要的作用[1]。所以EMT發(fā)展侵襲以有賴于血管的新生。VEGF[6,7]被認(rèn)為是目前具有最強的促血管生長作用的一種血管生長因子，在新生血管的生成過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。檢測血管生成因子VEGF及其可溶性受體sflt-1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)，探究血管生成因子在EMT發(fā)生發(fā)展中的作用，能進(jìn)一步推進(jìn)EMT發(fā)病機制的生物分子學(xué)研究，為疾病的早期診治尋找無創(chuàng)的生物學(xué)檢測方法。

3.1 VEGF在EMT患者血清和異位內(nèi)膜中的表達(dá)

VEGF是具有最高特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂劑，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂進(jìn)行增生，促進(jìn)局部新生毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)的形成[8]。本實驗結(jié)果顯示VEGF在兩組，實驗組患者血清中的表達(dá)水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時，許曉月、崔軼凡[9,10]等研究表明，EMT患者血清中發(fā)現(xiàn)VEGF呈高表達(dá)。與本研究結(jié)論相符。在EMT患者血清中VEGF的表達(dá)存在異常，證明VEGF在EMT發(fā)病過程中可能存在促進(jìn)的作用，同時也可為未來早期發(fā)現(xiàn)并診斷內(nèi)異癥的提供新的檢測指標(biāo)。卵巢激素能夠促進(jìn)內(nèi)膜細(xì)胞分泌VEGF，由于EMT的異位病灶與子宮在位的內(nèi)膜組織具有同源性，所以異位內(nèi)膜在卵巢激素影響下也能分泌VEGF，VEGF可使細(xì)胞外基質(zhì)降解，使基質(zhì)的屏障作用被破壞，使局部的微環(huán)境改變，從而促進(jìn)異位病灶的進(jìn)一步發(fā)生和發(fā)展[11]。李燦宇等[12]實驗結(jié)果顯示，VEGF在EMT的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達(dá)水平均高于在正常內(nèi)膜組織中的水平，且VEGF在在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本課題結(jié)果顯示，兩組組織中VEGF mRNA的水平比較，實驗組明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），于上述研究結(jié)果相一致。VEGF mRNA在異位內(nèi)膜中的高表達(dá)，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分裂，促進(jìn)新血管的形成，使異位內(nèi)膜得以成功種植、發(fā)展，異位病灶進(jìn)一步浸潤、蔓延，對盆腔周圍組織的破壞不斷擴(kuò)大，使盆腔周圍組織的粘連等病理變化呈持續(xù)性發(fā)展。

3.2 sflt-1在EMT患者血清中和內(nèi)膜組織中的表達(dá)

VEGFR-1在機體中可分解為sflt-1，sflt-1為VEGF的受體之一，兩者之間具有高度的親和力，VEGF與sflt-1結(jié)合后可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂，從而促進(jìn)血管生成[13]。VEGF本身不具有生物學(xué)活性，需與VEGFR高度結(jié)合誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，而促進(jìn)血管生成[14]。本實驗檢測兩組血清中的sflt-1水平，結(jié)果顯示sflt-1在實驗組血清中的濃度明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。有研究認(rèn)為VEGF可能促進(jìn)sflt-1的進(jìn)一步分泌，黃佼等[15]研究指出，sflt-1在EMT患者血清中的水平與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)，EMT患者血清中sflt-1水平的檢測能有效的體現(xiàn)血管的生成能力。也證實了本研究的觀點。sflt-1和VEGF的高表達(dá)及結(jié)合，能誘導(dǎo)異位內(nèi)膜中的腺體細(xì)胞的異常分化，影響著炎性因子在異位病灶內(nèi)膜組織中的表達(dá)，促進(jìn)了病灶在局部組織中的侵襲、浸潤及蔓延[16]。上述實驗結(jié)果已經(jīng)提示，在異位內(nèi)膜中VEGF mRNA呈現(xiàn)高水平，而關(guān)于sflt-1 mRNA在異位內(nèi)膜中的表達(dá)，本研究結(jié)果顯示，sflt-1 mRNA在實驗組中的表達(dá)高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示sflt-1可能參與到EMT疾病的發(fā)生發(fā)展中，使得局部異位灶內(nèi)膜組織具有更強的血管生長和增殖能力，存在異常的生物活性。

VEGF及sflt-1在EMT發(fā)病過程中的作用，可能包括：①sflt-1與血管的發(fā)芽即新血管生成的位置有關(guān)[17]，sflt-1與VEGF結(jié)合可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化、增加微血管通透性，促進(jìn)間質(zhì)生成，促進(jìn)血管的生長，為異位內(nèi)膜組織細(xì)胞的生長提供血流供應(yīng)，增加病灶的增殖活性；②sflt-1可以通過增加異位內(nèi)膜腺體細(xì)胞的侵襲能力，使盆腔組織的被侵襲破壞、不斷浸潤周圍組織，使盆腔的粘連等病理變化呈持續(xù)性發(fā)展[18]；③子宮內(nèi)膜隨經(jīng)血逆流并在盆腔組織上種植后，異位病灶受卵巢激素周期性的影響而不斷生長，但異位病灶缺少在位子宮內(nèi)膜的基底層結(jié)構(gòu)，缺少血流的供應(yīng)，使局部的組織處于相對缺氧的狀態(tài)。相關(guān)基因水平的研究表明，缺氧環(huán)境可直接提高VEGF的表達(dá)，促進(jìn)新生血管的生成[19]；④同時，VEGF可破壞細(xì)胞外基質(zhì)，影響基質(zhì)的屏障作用，加重局部基底膜的破損，加快異位病灶生長、浸潤及蔓延，而異位病灶的生長又增加了VEGF的分泌表達(dá)，使病灶不斷地擴(kuò)大、發(fā)展、侵襲，使疾病呈持續(xù)性加重[20]。

綜上所述，血管生長在EMT的發(fā)病過程中起著不可替代的重要作用，VEGF和sflt-1組成了高度親和力的血管生成信號通路，在血管生成的整個過程中都參與了調(diào)控的作用，VEGF及sflt-1在EMT患者的血清及異位內(nèi)膜中都出現(xiàn)高表達(dá)，提示對疾病的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著促進(jìn)的作用，可為EMT的早期診斷的無創(chuàng)性敏感性檢測方法提供新方法，同時也提供了EMT的抗血管治療的新思路。