LncRNA H19通過海綿miR-675和上調CDH13的表達促進肺癌的增殖、侵襲和上皮-間質轉化*

杜偉 王山水 張煥煥

(1.青島大學附屬醫院呼吸內科，山東 青島 266071；2.濟寧醫學院附屬高唐縣人民醫院ICU，山東 聊城 252800；3.濟寧醫學院附屬高唐縣人民醫院呼吸內科，山東 聊城 252800)

肺癌是世界上最主要的惡性腫瘤[1]。盡管肺癌治療技術的不斷發展，但患者5年生存率仍然很低[2]。此外，肺癌患者在治療后經常復發，甚至出現在早期。因此，深入了解肺癌發生發展的分子機制，對于尋找新的治療靶點和開發新的治療方法具有重要意義。長鏈非編碼RNA(Long non-coddg RNAs, LncRNA)是一種有200多個核苷酸且缺乏開放閱讀框架的RNA[3]。LncRNA參與多種生物學過程，包括細胞生長、腫瘤發生和腫瘤轉移[4-5]。印跡基因H19是1990年首次發現的LncRNA。H19在多種癌癥中異常表達，包括胃癌、肺癌、結腸癌和肝癌[6-7]。研究表明，H19調控上-皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)，促進癌細胞增殖和轉移[8]。另外研究表明LncRNA通過海綿吸附微小RNA(miRNA)來發揮其生物學功能[9]。例如，H19海綿miR-138提高HMG1的表達，從而促進結腸癌的遷移和侵襲[10]。LncRNAH19通過靶向miR-675/EHZ2調控結腸癌細胞的增殖[11]。miR-141通過調控LncRNA H19和LncRNA H19衍生的miR-675的靶基因調控成骨細胞增殖[12]。有報道稱H19在肺癌中過表達，并與細胞增殖相關，但目前尚不清楚H19在肺癌中是否還有其他功能及作用機制。有研究發現在胰腺癌細胞、前列腺癌細胞轉移進程和頭頸部鱗狀細胞癌的發生過程中LncRNA H19與miR-675具有靶向作用[13-15]，然而在肺癌SPC-A1細胞發展中二者是否具有同樣的靶向作用仍不明確。因此，本實驗主要通過探討LncRNA H19對肺癌SPC-A1細胞發展的影響，進一步闡明肺癌的發病機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及實驗試劑 肺癌SPC-A1細胞、A549細胞、HCC827細胞和人正常肺上皮BEAS-2B細胞購自中國科學院上海細胞庫。DMEM培養基選購自山東致圣生物科技有限公司。Trizol購自北京百奧萊博科技有限公司。MTT檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。H19 siRNA、pcDNA-H19、CDH13 siRNA等質粒由上海生物工程有限公司合成。Transwell小室購自Corning公司。miR-675抑制劑和miR-675模擬物來自Genepharma公司。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、GAPDH及其CDH13抗體購自Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將肺癌SPC-A1細胞、A549細胞、HCC827細胞和人正常肺上皮BEAS-2B細胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。培養基中添加100 U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素，細胞匯合至95%時消化傳代。

1.2.2 細胞轉染 培養SPC-A1細胞至生長密度為 90% 左右時加入胰蛋白酶消化，用含10% FBS的 DMEM 重懸細胞并接種至12孔板，于37℃、5% CO2培養箱過夜孵育，觀察細胞密度達 70% 時，PBS 清洗 1 次，用Turbofect試劑將質粒轉染SPC-A1細胞，持續在標準培養箱中培養。

1.2.3 細胞活力測定 以1.5×103/孔的密度將SPC-A1細胞接種于96 孔板，每組設3 個復孔，用Turbofect試劑將質粒轉染SPC-A1細胞，48 h后檢測細胞增殖能力。檢測時每孔細胞加入20 μL 濃度為5 mg/mL的噻唑藍(MTT)，孵育 4 h，每孔細胞加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，10 min后在酶聯免疫檢測儀570 nm 處測量各孔細胞吸光度值，重復3次后取平均值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測 先進行LncRNA H19及其miR-675靶基因的預測，接著構建H19野生型、H19突變型、CDH13 野生型、CDH13突變型載體，再分別與Genepharma公司合成的miR-675模擬物、模擬物對照共轉染至細胞，分析48 h后的熒光素酶活性。

1.2.5 細胞侵襲實驗 將已鋪好Matrigel 基質的Transwell上室靜置12 h。將轉染 48 h 的SPC-A1細胞常規消化，用無FBS的培養基稀釋細胞密度為1.0×105/mL，將稀釋后的200 μL 細胞懸液加入小室上層，Transwell下層加入500 μL含10% FBS的DMEM，培養箱孵育24 h，4%多聚甲醛固定SPC-A1細胞，0.1%結晶紫染色浸染20 min，置于顯微鏡下觀察SPC-A1細胞侵襲情況。

1.2.6 實時定量PCR 利用 Trizol 法分別提取轉染成功的SPC-A1細胞總RNA并逆轉錄為cDNA。采用SYBR Green RT-PCR試劑盒按照說明書的方案進行實時定量PCR檢測，以 GAPDH 為內參，計算2-△△Ct值作為相對表達量，實驗重復 3 次以上。 反應如下: 95℃預變性 20 s，95℃ 10 s，60℃ 退火 20 s，72℃ 延伸10 s，共 40 個循環。RT-qPCR引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot檢測轉染成功后的SPC-A1細胞總蛋白 提取轉染成功后的SPC-A1細胞總蛋白，取50 μg蛋白進行蛋白質樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，與特異性一抗(GAPDH、E-cadherin、N-cadherin和CDH13)在4℃孵育過夜; TBST清洗膜5次，PVDF膜與二抗 37℃孵育1 h; TBST洗膜5次，根據蛋白大小分析條帶。

2 結果

2.1 H19 siRNA轉染SPC-A1細胞后分析敲低H19表達對細胞增殖、侵襲及EMT的影響 首先利用RT-qPCR技術分析了SPC-A1、A549、HCC827細胞和BEAS-2B細胞中H19的差異表達，結果顯示SPC-A1(2.98±0.25)、A549(2.47±0.75)、HCC827(2.06±0.51)細胞中LncRNA H19表達量明顯高于BEAS-2B細胞(1.25±0.16)(P<0.05)，且LncRNA H19在SPC-A1細胞中的表達量最高，因此后續實驗選擇SPC-A1細胞用于研究。培養SPC-A1細胞，分別轉染H19 siRNA及其對照siRNA NC質粒，48 h后分析細胞活性，分析MTT結果發現siRNA敲低H19在SPC-A1細胞中的表達后顯著下調細胞活力(P<0.05)，見圖1A；進一步分析Western blot及其Transwell結果可知，siRNA能敲降H19在SPC-A1細胞中的表達后明顯降低了N-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，并減少了細胞侵襲數目(P<0.05)，卻上調了E-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，見圖1B～E。

圖1 下調LncRNA H19抑制SPC-A1細胞的增殖、侵襲及EMT

2.2 LncRNA H19直接靶向結合miR-675 先通過miRanda分析預測LncRNA H19 3′UTR與其潛在作用靶點miR-675的結合位點(圖2A)。后續研究結果表明轉染H19 wt的雙熒光素酶報告實驗中，miR-675 mimics組SPC-A1細胞熒光素酶活性明顯低于mimics NC組(P<0.05)，轉染H19 mut的雙熒光素酶報告實驗中，和mimics NC組對比，miR-675 mimics組SPC-A1細胞熒光素酶活性比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2B。RT-qPCR結果顯示，LncRNA H19 siRNA組SPC-A1細胞內miR-675表達量(1.83±0.98)明顯高于siRNA NC組(0.92±0.27)(P<0.05)。

圖2 miRanda及其雙熒光素酶報告法驗證LncRNA H19與miR-675之間的靶向關系

2.3 下調miR-675促進SPC-A1細胞的增殖、侵襲及EMT 首先利用RT-qPCR技術分析了SPC-A1和BEAS-2B細胞中miR-675的差異表達，結果顯示SPC-A1細胞中miR-675表達量(0.27±0.83)明顯低于BEAS-2B細胞(1.09±0.53)(P<0.05)。培養SPC-A1細胞，分別轉染miR-675 inhibitor及其對照inhibitor NC質粒，48 h后分析細胞活性，分析MTT結果發現敲降miR-675在SPC-A1細胞中的表達后顯著上調細胞活力(P<0.05)，見圖3A；進一步分析Western blot及其Transwell結果可知，敲降miR-675在SPC-A1細胞中的表達后明顯降低了E-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，并上調了細胞侵襲數目(P<0.05)和N-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，見圖3B～E。

圖3 下調miR-675促進SPC-A1細胞的增殖、侵襲及EMT

2.4 過表達LncRNA H19與miR-675后進一步分析SPC-A1細胞的增殖、侵襲及EMT情況 過表達H19后顯著上調了SPC-A1細胞活力、細胞侵襲數目與N-cadherin表達(P<0.05)，卻下調了E-cadherin表達(P<0.05)，而過表達miR-675顯著下調了細胞活力、細胞侵襲數目與N-cadherin表達(P<0.05)，卻上調了E-cadherin表達(P<0.05)。與過表達miR-675組對比，過表達H19及miR-675上調了SPC-A1細胞活力、細胞侵襲數目與N-cadherin表達(P<0.05)，卻下調了E-cadherin表達(P<0.05)。見圖4。

圖4 上調Lnc RNA H19通過miR-675促進SPC-A1細胞的增殖、侵襲及EMT

2.5 miR-675與CDH13之間的靶向和負調控關系 TargetScan預測的miR-675與CDH13的結合位點(圖5A)。轉染CDH13 wt的雙熒光素酶報告實驗中，miR-675 mimics組SPC-A1細胞熒光素酶活性明顯低于mimics NC組(P<0.05)，轉染CDH13 mut的雙熒光素酶報告實驗中，和mimics NC組對比，miR-675 mimics組SPC-A1細胞熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，見圖5B。RT-qPCR結果顯示，miR-675inhibitor組SPC-A1細胞內CDH13表達量(2.03±0.45)明顯高于inhibitor NC組(1.03±0.54)(P<0.01)。

圖5 TargetScan及其雙熒光素酶報告法驗證miR-675與CDH13的關系

2.6 CDH13 siRNA轉染SPC-A1細胞后分析敲低CDH13表達對細胞增殖、侵襲及EMT的影響 首先利用RT-qPCR技術分析了SPC-A1和BEAS-2B細胞中CDH13的差異表達，結果顯示SPC-A1細胞中CDH13表達量(2.21±0.52)明顯高于BEAS-2B細胞(1.13±0.45)(P<0.05)。培養SPC-A1細胞，分別轉染CDH13 siRNA及其對照siRNA NC質粒，48 h后分析細胞活性，分析MTT結果發現siRNA能敲降CDH13在SPC-A1細胞中的表達后顯著下調細胞活力(P<0.05)，見圖6A；進一步分析Western blot及其Transwell結果可知，siRNA技能敲降CDH13在SPC-A1細胞中的表達后明顯降低了N-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，并減少了細胞侵襲數目(P<0.05)，卻上調了E-cadherin/GAPDH值(P<0.05)，見圖6B～E。

圖6 下調CDH13抑制SPC-A1細胞的增殖、侵襲及EMT

2.7 LncRNA H19、miR-675與CDH13之間的調控關系 pcDNA-H19+mimics NC組CDH13 mRNA和蛋白表達量明顯高于pcDNA-3.1(+)+mimics NC組，pcDNA-3.1(+)+miR-675 mimics組CDH13 mRNA及蛋白表達量明顯低于pcDNA-3.1(+)+mimics NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。pcDNA-H19+miR-675 mimics組CDH13 mRNA及蛋白表達量明顯高于pcDNA-3.1(+)+miR-675 mimics組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7。以上結果表明LncRNA H19與CDH13存在正調控關系，miR-675與CDH13存在負調控關系，LncRNA H19可能通過miR-675調控CDH13表達。

圖7 LncRNA H19、miR-675與CDH13之間的調控關系

3 討論

近年來，盡管肺癌發病機制的研究有了突破性的進展，但晚期肺癌患者的預后仍然不理想。因此，揭示控制這種惡性表型的分子開關，闡明肺癌轉移進化的潛在機制具有重要意義。大多數人類惡性腫瘤起源于上皮組織，EMT的研究不僅有利于肺癌，也有利于大部分實體惡性腫瘤。然而，目前對于LncRNA和其他RNA轉錄本在調控EMT中的功能作用知之甚少。近年來，長度超過200個核苷酸的長鏈非編碼RNA作為一類新的調控基因表達的功能調控元件出現，許多LncRNA與多種人類疾病有關[16-17]。近些年研究發現LncRNA H19參與調控各種癌癥的發展[18]。有文獻報道LncRNA H19的下調可通過調控miR-18b/IGF1軸使順鉑致敏黑色素瘤細胞[19]。高水平的LncRNA H19表達與食管鱗癌患者更短的生存期相關[20]。此外，抑制LncRNAH19在非小細胞肺癌體內具有抗腫瘤和增強對吉非替尼和化療敏感性的作用[21]。以上研究充分說明了LncRNA H19在腫瘤細胞發展進程中發揮了重要作用，而且我們還發現LncRNA H19在癌細胞中異常表達后會行使生物學功能。因此我們在本研究中首先檢測了LncRNA H19是否在肺癌細胞中有差異表達，結果發現LncRNA H19在肺癌SPC-A1細胞、A549細胞、HCC827細胞中表達上調，且在SPC-A1細胞中表達量最高。后續功能研究發現LncRNA H19是調節EMT進展的新參與者，過表達H19可以顯著促進SPC-A1細胞的增殖和侵襲[22]。我們的研究結果也表明H19在肺癌進展中具有關鍵作用，值得進一步深入探討。

研究表明LncRNA可以調控miRNA在癌癥發展中的功能[23]。有報道稱，H19作為分子海綿拮抗let-7家族，從而調控各種生物學過程[24]。H19也可抑制喉鱗癌中的miR-148a-3p[21]。另外發現LncRNA H19通過miR-29b-3p作為競爭性內源性RNA調控膀胱癌上皮-間質轉化和轉移[25]。此外，LncRNA H19過表達通過miR-29b-3p靶向MCL-1誘導多發性骨髓瘤硼替佐米耐藥[26]。本研究發現H19靶向且負調控了SPC-A1細胞中miR-675的表達。這些發現可以推斷miR-675在H19下游發揮作用。我們查閱相關文獻發現miR-675在腫瘤細胞惡性發展進程中具有明顯的抑癌作用，在癌細胞中表達量顯著下調[27]。因此我們繼續研究了miR-675的生物學功能，研究結果表明miR-675在SPC-A1細胞中表達量明顯下降，下調miR-675促進SPC-A1細胞的增殖、侵襲及EMT，而上調LncRNA H19通過miR-675促進SPC-A1細胞的增殖、侵襲及EMT，這表明在肺癌中H19調控的SPC-A1細胞增殖和侵襲可能受miR-675表達的調控。此外，TargetScan預測和雙熒光素酶實驗結果提示我們miR-675和CDH13具有靶向關系，我們發現CDH13在SPC-A1細胞中發揮了明顯的促癌作用，這與CDH13在結直腸癌、食管癌及乳腺癌等腫瘤中發揮的作用一致[28]。我們還發現LncRNA H19不僅能海綿miR-675，還能夠上調CDH13表達，表明LncRNA H19對SPC-A1細胞增殖、侵襲和EMT的影響是通過海綿miR-675和上調CDH13表達實現的。

4 結論與啟示

本研究發現LncRNA H19作為一種致癌基因，通過海綿miR-675和上調CDH13促進了肺癌SPC-A1細胞的發展，其可能是治療肺癌的一個新的潛在靶點，可進一步深入研究。