芪薊腎康湯對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞增殖及STAT3、SOCS3表達(dá)的影響

郭建儀，呂靜，張春輝，莊曉巖，張忠勝

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

IgA腎病(IgA nephropathy)是指以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積在腎小球系膜區(qū)的腎小球疾病[1]。流行病學(xué)顯示，在中國乃至世界，IgA腎病在原發(fā)性腎小球疾病中發(fā)病率始終高居首位，此病最終會(huì)發(fā)展成為終末期腎病[2]。目前，IgA腎病的具體發(fā)病原因尚不清楚，其臨床治療藥物西醫(yī)多選擇糖皮質(zhì)激素或者免疫抑制劑，但后期隨著用藥劑量的增加，極容易出現(xiàn)肝腎損害，誘發(fā)感染[3]。陳以平全國名老中醫(yī)工作室通過對(duì)IgA腎病做回顧性分析，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均可改善IgA腎病患者的腎功能減退，越早加入中醫(yī)藥治療，越能延緩腎功能下降[4]。

芪薊腎康湯是專利方，臨床有效治療IgA腎病30多年。JAK/STAT信號(hào)通路是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的常用途徑[5]，可能與IgA腎病存在聯(lián)系。轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)能夠激活通路并促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)作為負(fù)調(diào)節(jié)因子，則反向抑制[7]。因此，為研究芪薊腎康湯治療IgA腎病的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察芪薊腎康湯低、中、高劑量組及替米沙坦組對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)影響，采用ELISA法檢測(cè)血清中STAT3蛋白表達(dá)的情況,qPCR法檢測(cè)SOCS3 mRNA 表達(dá)量，分析芪薊腎康湯治療IgA腎病作用機(jī)制及靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

40只健康雄性大鼠，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SCXK(遼)2015-0001，飼養(yǎng)在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 細(xì)胞株

人腎小球系膜細(xì)胞株，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.3 中藥材

芪薊腎康湯(黃芪、丹參、牡丹皮、仙鶴草、重樓、白花蛇舌草、老頭草、小薊等8味中藥)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供；替米沙坦片(80 mg/片，上海勃林格殷翰藥業(yè)有限公司)。

1.4 主要儀器及試劑

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ，Wako公司)；ROX plus(Takara公司)；小牛血清(FBS，GIBICO公司)；STAT3 ELISA試劑盒(AMEKO公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(HyClone公司)；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，換成RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，接種到培養(yǎng)瓶中。在鏡下觀察細(xì)胞，等到細(xì)胞株覆蓋瓶底80%，吸出原培養(yǎng)液，丟棄，用緩沖液輕輕沖洗培養(yǎng)瓶，加胰酶3 mL，放置在37 ℃、0.5% 濃度的CO2培養(yǎng)箱消化5 min。消化之后，從培養(yǎng)箱取細(xì)胞，顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞完全脫離，終止消化，形成細(xì)胞懸液。在離心管中加細(xì)胞懸液15 mL，設(shè)置參數(shù)4 ℃、2 000 r/min，離心10 min，吸取上清，在細(xì)胞沉淀中加入完全培養(yǎng)液，備用。

2.2 血清制備

將40只大鼠隨機(jī)分為正常組，替米沙坦組(6.25 mg·kg-1·d-1)，芪薊腎康湯低、中、高劑量組(11.8、23.6、47.2 g·kg-1·d-1)。先適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，3 d后連續(xù)藥物灌胃5 d，1次/d。5 d之后，脫頸處死，解剖腹主動(dòng)脈，采血并分離血清，置于-20 ℃冰箱備用。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板，包括6組，正常組，模型組，替米沙坦組，芪薊腎康湯組分低、中、高劑量組。先培養(yǎng)24 h，24 h后吸出原培養(yǎng)液，在每孔加RPMI-1640 培養(yǎng)液150 μL。24 h后，棄上清，再按照分組加200 μL芪薊腎康湯或替米沙坦含藥血清，放到CO2培養(yǎng)箱。48 h之后，加入MTT培養(yǎng)液，終止培養(yǎng)，檢測(cè)OD值。

2.3.2 ELISA法檢測(cè)48 h、72 h STAT3表達(dá)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇在48 h、72 h 后取上清液，用ELISA試劑盒反應(yīng)并檢測(cè)OD值。

2.3.3 qPCR法檢測(cè)48 h SOCS3表達(dá)

引物由 Primer-BLAST[8]設(shè)計(jì)，內(nèi)參基因是人β-actin，所得Ct值利用2-△△CT公式[9]計(jì)算出SOCS3 mRNA的表達(dá)量，使用的引物序列及產(chǎn)物情況，見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖結(jié)果

各組增殖情況見表2。模型組與正常組相比，有明顯差異(P<0.01)，結(jié)合數(shù)值，模型組細(xì)胞增殖最為明顯，證明造模成功。與模型組相比較，替米沙坦組、芪薊腎康湯中劑量組和高劑量組結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，芪薊腎康湯高劑量組緩解細(xì)胞增殖效果最明顯，芪薊腎康湯高劑量組和中劑量組系膜細(xì)胞增殖情況都低于替米沙坦組。

表2 各組細(xì)胞增殖情況

3.2 芪薊腎康湯對(duì)STAT3的蛋白表達(dá)影響

48 h，在AngⅡ的刺激下，與正常組相比，模型組的STAT3含量明顯增高 (P<0.01)；與模型組相比，芪薊腎康湯高、中、低劑量組及替米沙坦組均能降低STAT3的蛋白表達(dá)(P<0.01)，而且隨著芪薊腎康湯劑量增加，降低STAT3的效果越明顯，中、低劑量組效果低于替米沙坦組，芪薊腎康湯高劑量組明顯高于替米沙坦組，作用最強(qiáng)(P<0.01)。72 h，與模型組相比，芪薊腎康湯高、中、低劑量組及替米沙坦組均有效降低STAT3的蛋白表達(dá)。說明芪薊腎康湯可以有效降低STAT3蛋白表達(dá)，見表3。

表3 各組48 h、72 h時(shí)STAT3含量

3.3 芪薊腎康湯對(duì)SOCS3的mRNA表達(dá)影響

基因表達(dá)結(jié)果表明，模型組SOCS3的mRNA表達(dá)與正常組相比顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，替米沙坦組，芪薊腎康湯低、中、高劑量組均可促進(jìn)SOCS3 mRNA表達(dá)(P<0.01)。芪薊腎康湯組隨著劑量的增加，促進(jìn)SOCS3 mRNA表達(dá)的效果越明顯。芪薊腎康湯中、低劑量組SOCS3 mRNA含量表達(dá)低于替米沙坦組，芪薊腎康湯高劑量組與替米沙坦組SOCS3 mRNA表達(dá)量相近。說明芪薊腎康湯能夠促進(jìn)SOCS3 mRNA的表達(dá)，抑制AngⅡ誘導(dǎo)下人腎小球系膜細(xì)胞的增殖狀態(tài)，見表4。

表4 各組SOCS3含量比較

4 討論

腎小球硬化是IgA腎病的重要病理特點(diǎn)[10]，會(huì)出現(xiàn)系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)積聚，其中局灶節(jié)段性腎小球硬化可以作為IgA腎病早期預(yù)后的指標(biāo)[11]。AngⅡ是公認(rèn)致腎小球硬化的因子[12]，因此選擇AngⅡ誘導(dǎo)HMCs增殖。替米沙坦是血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥，廣泛用于臨床腎病治療，減輕腎臟纖維化[13-14]，因此選擇替米沙坦作對(duì)比。

JAK/STAT信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖過程，可以與其他信號(hào)通路相互影響。JAK/STAT包括JAK相關(guān)受體、JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT，其中STAT蛋白是重要的生物標(biāo)志物。STAT家族包含STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6等7種蛋白[15]。細(xì)胞因子與JAK受體結(jié)合后會(huì)激活JAK，而活化的JAK能使STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3形成二聚體，結(jié)合靶基因，調(diào)控基因表達(dá)[16]。活化的STAT可促進(jìn)負(fù)性調(diào)節(jié)分子SOCS的表達(dá)，而SOCS3能阻斷STAT3與受體的結(jié)合，抑制STAT3的活化[17]。因此，檢測(cè)芪薊腎康湯和替米沙坦含藥血清對(duì)STAT3、SOCS3表達(dá)的影響，分析其可能的作用機(jī)制。

中醫(yī)學(xué)通常將IgA腎病歸于“尿血”“水腫”范疇。不同中醫(yī)學(xué)家對(duì)其發(fā)病機(jī)制有不同見解。王耀獻(xiàn)教授認(rèn)為風(fēng)邪為始發(fā)因素，與濕邪膠結(jié)致病，主張從風(fēng)濕論治，以搜風(fēng)祛濕為主[18]。劉光珍教授認(rèn)為在IgA腎病不同分期，血瘀貫穿始終，治療該以活血化瘀為主[19]。劉偉敬教授認(rèn)為應(yīng)從風(fēng)、虛、瘀論治[20]。吾師認(rèn)為虛、毒、瘀是致病之關(guān)鍵，因此從“補(bǔ)腎絡(luò)、清腎絡(luò)、消腎絡(luò)”角度進(jìn)行防治。芪薊腎康湯正是以此法立方，包括黃芪、丹參、牡丹皮、仙鶴草、重樓、白花蛇舌草、老頭草、小薊等8味中藥。

實(shí)驗(yàn)制備芪薊腎康湯低、中、高劑量含藥血清，作用于AngⅡ誘導(dǎo)的HMCs，檢測(cè)STAT3、SOCS3表達(dá)情況，并與正常組、模型組、替米沙坦組對(duì)照。ELISA法檢測(cè)STAT3蛋白含量，48 h時(shí)，STAT3模型組水平明顯高于正常組，說明造模成功；芪薊腎康湯組和替米沙坦組STAT3水平均明顯下降，芪薊腎康湯高劑量組STAT3含量最低，72 h結(jié)果與48 h基本相同。說明芪薊腎康湯與替米沙坦均可通過降低STAT3表達(dá)抑制HMCs增殖，隨著芪薊腎康湯劑量的增加，效果越明顯，高劑量組效果好于替米沙坦組。qPCR檢測(cè)48 h時(shí)SOCS3 mRNA表達(dá)情況，SOCS3是負(fù)性調(diào)節(jié)因子，與正常組相比，模型組含量明顯降低，說明造模成功；芪薊腎康湯組與替米沙坦組均可提高SOCS3 mRNA水平，替米沙坦組含量最高，芪薊腎康湯高劑量組含量也很高，且與替米沙坦組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明芪薊腎康湯與替米沙坦均可通過促進(jìn)SOCS3表達(dá)抑制HMCs增殖，隨著芪薊腎康湯劑量的增加，效果越好。

綜上所述，芪薊腎康湯可以通過正向降低STAT3表達(dá)，反向促進(jìn)SOCS3表達(dá)，抑制HMCs增殖，緩解腎小球硬化。這可能是芪薊腎康湯改善IgA腎病的分子機(jī)制之一。