刺五加對大鼠睡眠-覺醒節律的影響及腦內GABA、L-Glu含量變化的研究

張正一，李廷利，王艷艷，于爽，黃莉莉，楊帆，卞宏生

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

人類的睡眠-覺醒行為是千百年來與晝夜節律相適應而形成的一種穩定的行為特征，是人類生命活動的重要內容，與人的生命健康息息相關。但據世界衛生組織調查表明，全球27%的人都存在睡眠問題。研究發現，當今由于人們的生活方式發生了重大改變，諸多因素如因熬夜學習、工作、上網等人為延長光照時間[1]，飲食無規律[2]等破壞了晝夜節律，進而影響了機體的睡眠-覺醒節律。其中，人為地延長光照時間是造成睡眠-覺醒節律變化的重要原因，導致失眠，威脅人們的生命健康[3]。而現代研究表明，腦內谷氨酸(Glu)，γ-氨基丁酸(GABA)是睡眠調節中不可或缺的重要因素[4]，亦是研究睡眠機制的重要切入點之一。

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根和根莖或莖[5]。早在南北朝時期，《炮炙論》中對刺五加就有“陽人使陰，陰人使陽”的記載[6]。現代研究發現刺五加對睡眠節律有調節作用，在治療失眠、神經衰弱等方面有顯著療效。研究發現刺五加中有多種成分均具有使患者提前入睡、增加睡眠時間和深度的功效[7]。課題組也發現刺五加對睡眠節律有調節作用，可減少24 h持續黑暗環境下果蠅的片段化睡眠[8]。

基于此，本文在前期研究的基礎上，利用實驗動物監測系統，以SD雄性大鼠為研究對象，探討刺五加對大鼠睡眠-覺醒節律的影響及腦內GABA、L-Glu含量的變化。

1 材料

1.1 儀器

實驗動物監測系統：型號CLAMS，美國COLUMBUS公司(注：該系統由活動評價模塊和睡眠探測分析模塊兩部分組成，構成系統的睡眠高通量篩選功能)；多功能酶標儀：型號SynergyMx,美國伯騰儀器有限公司；分析天平：型號MS204S，美國梅特勒一托力多儀器上海有限公司；高速低溫冷凍離心機：型號3-18R(3006004)，美國TOMOS有限公司。

1.2 藥品與試劑

刺五加浸膏(刺五加苷B含量為0.546%，刺五加苷E含量為0.328%,由黑龍江中醫藥大學中藥藥理教研室提供)，臨用時以生理鹽水配制成24.3 mg/mL的溶液；戊巴比妥鈉，國藥集團化學試劑有限公司，批號WS20060401，臨用時以生理鹽水配制成0.5 mg/mL溶液；GABA ELISA Kit，R&D Systems Inc，Lot 20180501A；L-Glu ELISA Kit，R&D Systems Inc，Lot 20180501A。

1.3 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質量(300±50)g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。實驗環境為屏蔽、隔音、避光、通風狀態，采用自動定時光控系統對大鼠的生活環境實行12 h/12 h明暗交替的光照周期處理(即7∶00—19∶00光照；19∶00—次日7∶00黑暗)，光照強度：300 lux，濕度：40 %～70 %，室溫：(24±3) ℃，噪聲≤40 dB。

2 方法

2.1 刺五加對持續光照條件下大鼠睡眠-覺醒節律的干預研究

將大鼠在實驗環境下飼養1周，適應環境，期間自由飲水和獲取食物。1周后取大鼠18只，隨機分為正常光照組(LD組)、持續光照組(LL組)、給藥組(LLG組)，每組6只。分別將LD組、LL組大鼠放于CLAMS系統內，設定采集率為1samples/30 s，即系統每30 s自動收集1次樣本數據。以活動次數count=0，活動閾值epochs=30 s下，單籠飼養，在正常光照和持續光照條件下，于19∶00—20∶00定時給予與LLG組等劑量的生理鹽水，連續7 d，記錄大鼠的睡眠-覺醒節律以及睡眠時間。將LLG組大鼠放于CLAMS系統內，設定同上，進行連續7 d的持續光照后，于19∶00—20∶00定時給予60.75 mg/kg刺五加溶液，連續7 d，記錄大鼠的睡眠-覺醒節律以及睡眠時間。

2.2 刺五加對持續光照條件下大鼠腦內GABA、L-Glu的含量變化研究

將大鼠在實驗環境下飼養1周，適應環境，期間自由飲水和獲取食物。1周后取SD大鼠30只，隨機分為正常光照白天組、正常光照夜晚組、持續光照白天組和持續光照夜晚組，給藥白天組，給藥夜晚組，每組6只。將6組大鼠按照上述方法進行實驗，于給藥的最后1日11∶00和23∶00，分別戊巴比妥鈉腹腔注射使大鼠麻醉(40 mg/kg)后斷頭取腦，在分析天平中精密稱重后，加入9倍量的生理鹽水在冰浴中勻漿，將勻漿液離心，3 000 r/min離心10 min，分離上層血清，置于低溫冰箱中保存。根據試劑盒說明書操作，數據記錄在Excel工作表中，以標準品的濃度為橫坐標，對應OD值為縱坐標，繪制出標準線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。(注：11∶00和23∶00的時間選取由睡眠-覺醒節律圖以及睡眠時間中具有顯著性差異的時間段所決定)

2.3 統計學處理

3 結果

3.1 刺五加對持續光照條件下大鼠睡眠-覺醒節律的干預研究

3.1.1 刺五加對持續光照條件下大鼠睡眠-覺醒節律的研究

正常光照組大鼠的睡眠-覺醒呈現晝夜節律變化，節律周期穩定。表現為大鼠白天的休息間隔較多處于睡眠狀態，夜晚的活動間隔較多處于覺醒狀態，且睡眠呈現片段化。與正常光照組比較，持續光照組大鼠的睡眠-覺醒節律的節律相位后置，晝夜節律特征退化，節律周期改變。在最初的1 d內大鼠的節律仍保持為作為夜行動物的基本節律，隨著時間的延長，節律相位后置日趨明顯，從第2 天起大鼠的晝夜節律明顯發生改變，表現為大鼠9∶00—11∶00較多處于覺醒狀態，19∶00—23∶00較多處于睡眠狀態，且睡眠呈現片段化。這種現象以第7天最明顯，詳見圖1。

注：A.LD組；B.LL組；C.LLG組。箭頭顯示第7天結果。

3.1.2 刺五加對持續光照條件下大鼠睡眠時間的研究

結果顯示,與正常光照組比較，第7天，9∶00—11∶00持續光照組睡眠時間減少，差異有統計學意義(P<0.05)。19∶00—21∶00、19∶00—21∶00、21∶00—23∶00、23∶00—1∶00及5∶00—7∶00持續光照組睡眠時間均增多，差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。與持續光照組比較，第7天，9∶00—11∶00給藥組睡眠時間增多，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 各時間段刺五加對持續光照條件下大鼠睡眠時間的影響

3.2 刺五加對持續光照條件下大鼠腦內GABA、L-Glu的含量變化研究

實驗結果表明，在11∶00時，與正常光照組比較，持續光照組GABA含量下降，L-Glu含量升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與持續光照組比較，給藥組GABA含量升高(P<0.05)。在23∶00時，與正常光照組比較，持續光照組GABA含量升高，L-Glu含量下降，差異均具有統計學意義(P<0.05)；與持續光照組比較，給藥組GABA含量下降，差異均具有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 刺五加對持續光照條件導致大鼠腦內GABA、L-Glu含量變化的干預作用

4 討論

隨著社會的發展和進步，諸如跨時區交流、加班倒班、手機上網等工作或娛樂活動日趨普遍，人們面臨的睡眠問題也逐漸發生變化[9]。通過對中國知網近10年的檢索報告進行分析發現,以“睡眠”和“節律”為主題的相關研究報告呈現大幅度上升趨勢，其中節律紊亂性睡眠障礙正在成為威脅現代人身心健康的重要問題，引起學者的高度關注[10-11]。

針對這種節律紊亂導致的失眠問題，中醫藥有其獨特的認識。《本草綱目》記載刺五加具有“補中益氣，強筋骨意志，久服輕身耐老”的功效。2020年版《中國藥典》也指出其“益氣健脾，補腎安神”的作用。現代研究發現，刺五加具有改善心腦血液循環、調節中樞神經和內分泌系統的功能，對習慣性失眠、神經衰弱和食欲不振有顯著療效[12-13]。目前，刺五加已成為一種“適應原”樣藥物和保健食材被很多國家廣泛使用，且基本無不良反應報道[14]。

現有文獻報道，L-Glu與GABA是腦內最重要的興奮性和抑制性神經遞質，對大腦皮層、丘腦、海馬神經元有很強的興奮作用，而腦內的L-Glu與GABA代謝主要通過L-Glu/GABA-Gln代謝環路進行循環。研究發現L-Glu/GABA-Gln的興奮/抑制功能失衡與睡眠-覺醒節律密切相關[7-9]，L-Glu/GABA-Gln代謝環路是腦內L-Glu和GABA代謝轉換的主要途徑[10]，因此考慮睡眠-覺醒節律改變是否與L-Glu/GABA-Gln代謝環路的失衡相關。

本研究利用實驗動物監測系統CLAMS和酶聯免疫測定技術，以睡眠-覺醒節律和睡眠時間以及腦內GABA、L-Glu等睡眠促進物質為指標，研究刺五加改善持續光照條件下大鼠睡眠-覺醒節律的作用及其腦內GABA、L-Glu的含量變化研究。

目前分析睡眠-覺醒狀態的常用方法有3種，分別是皮層腦電圖(EEG)、視頻數字分析方法，以及利用CLAMS紅外光束IR的高通量篩選方法，本文利用CLAMS記錄大鼠睡眠-覺醒節律，優勢在于在不損傷動物的前提下，可以長時間進行記錄大鼠的活動狀態，從而繪制睡眠-覺醒節律圖。

在刺五加對持續光照條件下大鼠睡眠-覺醒節律的干預研究中發現,刺五加可以通過調整大鼠的睡眠-覺醒節律分布，使處于持續光照條件下大鼠的睡眠-覺醒節律紊亂現象得到恢復，與正常光照組相比，持續光照條件下的大鼠，在9∶00—11∶00多處于覺醒狀態，21∶00—23∶00多處于睡眠狀態的睡眠-覺醒行為表現，經過刺五加給藥后又恢復到與正常光照組相近的節律分布，可以看出在9∶00—11∶00多處于睡眠狀態，21∶00—23∶00多處于覺醒狀態，這種現象以11∶00和23∶00前后最為突出。且通過對睡眠覺醒節律圖以及睡眠時間的研究，我們可以發現，無論是將持續光照組大鼠與正常光照組大鼠相比較，還是將給藥組大鼠與持續光照組大鼠相比較，11∶00和23∶00這兩個時間段，差異都具有統計學意義(P<0.05)。基于此，在大鼠腦內GABA、L-Glu含量研究中，選定11∶00和23∶00這兩個時間段，進行大鼠斷頭取腦的操作，利用酶聯免疫測定技術，測定腦內GABA、L-Glu的含量，結果發現,在11∶00時，與正常光照組比較，持續光照組GABA含量下降，L-Glu含量升高；與持續光照組比較，給藥組GABA含量升高，具有顯著性差異(P<0.05)。在23∶00時，與正常光照組比較，持續光照組GABA含量升高，L-Glu含量下降；與持續光照組比較，給藥組GABA含量下降，具有顯著性差異(P<0.05)。

本研究從較為直觀的角度，即睡眠-覺醒節律圖和睡眠時間，展現了刺五加可以改善大鼠的睡眠-覺醒節律；并通過L-Glu和GABA含量的變化，探討了刺五加能通過調節大鼠的節律分布來改善大鼠的睡眠，其作用機制可能是通過影響L-Glu、GABA的含量變化而改善大鼠的睡眠-覺醒節律。本研究從睡眠-覺醒節律角度揭示了刺五加改善睡眠的機制，同時為其他相關中藥及制劑改善睡眠的研究提供了參考。