miR-489-3p靶向PTEN/PI3K/Akt信號通路對膀胱癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響

王哲，張敬，吳仁通，張潮，陳懷安，苗文隆

膀胱癌(bladder cancer，BC)是我國常見的泌尿系統惡性腫瘤，男性發病率是女性的3～4倍，大部分患者只能通過藥物治療來緩解病情[1-2]。因此，明確BC的發展機制、尋找有效的分子靶點和診斷標志物是BC臨床治療的關鍵。微小RNA(miR)-489-3p已被證實參與調控BC等腫瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡[3-4]。在冠心病內皮細胞中，抑制miR-26a-5p表達可靶向第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)正調控磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路促進其細胞凋亡[5]。然而，miR-489-3p是否通過調控PTEN影響BC的增殖、凋亡、侵襲仍不清楚。因此，本研究將通過癌癥基因組圖譜(TCGA-BLCA)數據庫分析BC中差異表達的miRNA，并探討miR-489-3p與BC臨床病理特征的關系及其在BC細胞中的功能和潛在的分子機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織和細胞來源 收集2018年6月—2021年7月河北北方學院附屬第一醫院泌尿外科110例BC患者手術切取的癌組織及其癌旁組織，于-80℃冰箱冷凍保存，并收集BC患者的臨床病理資料。本研究獲得醫院倫理委員會批準(K2021095)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書，且術前均未進行放療或化療。人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1及人膀胱癌細胞系5637、J82、T24購自南京科佰生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器 (1)試藥、試劑：RPMI1640培養基、胎牛血清，購自美國HyClone公司；胰蛋白酶、Trizol、Lipofectamine 2000轉染試劑、噻唑藍(MTT)試劑、Transwell小室，均購自美國Invitrogen公司；PTEN、PI3K、Akt抗體及相應二抗，購自美國CST公司；逆轉錄試劑盒，購自上海賽默飛公司；SYBR premix Ex Taq PCR試劑盒，購自北京智杰方遠科技有限公司；Annexin-V/PI細胞凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自上海翌圣生物科技有限公司；miR-489-3p模擬物(miR-489-3p mimics)、miR-489-3p抑制物(anti-miR-489-3p)和陰性對照miR-NC、PTEN過表達重組載體(pc-PTEN)和空載體pcDNA，購自上海吉瑪制藥技術有限公司。(2)儀器、設備：StepOneTMPCR儀購自美國Thermo Fisher公司，Herocell 180 CO2細胞培養箱購自上海潤度生物科技有限公司，PowerPacTM電泳儀、GelDoc Go凝膠成像系統、iMark酶標儀購自美國Bio-Rad公司，DxFLEX流式細胞儀購自貝克曼庫爾特國際貿易(上海)有限公司。

1.3 細胞培養及分組 2021年1—7月進行細胞實驗。將人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1及人膀胱癌細胞系5637、J82、T24置于含有10%胎牛血清及青、鏈霉素混合液的RPMI1640培養基，在37℃、CO2含量為5%的細胞培養箱中培養。采用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-NC、miR-489-3p mimics、miR-489-3p mimics+pcDNA、miR-489-3p mimics+pc-PTEN分別轉染至生長狀態較好的T24細胞中，并記為：miR-NC組、miR-489-3p mimics組、miR-489-3p mimics+pcDNA組和miR-489-3p mimics+pc-PTEN組，另取常規培養的T24細胞作為對照組。48 h后收集各組T24細胞用于后續實驗。

1.4 差異miRNA的篩選 下載TCGA-BLCA miRNA測序數據，應用R軟件(3.6.3版本)中DESeq2包進行差異分析，并使用ggplot2包繪制火山圖，藍色為低表達，紅色為高表達，篩選參數：LogFC>1且P<0.05。

1.5 觀測指標與方法

1.5.1 miR-489-3p和PTEN mRNA水平檢測：采用Trizol法提取RNA，使用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA，然后根據SYBR premix Ex Taq PCR試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR反應。采用2-ΔΔCt方法計算miR-489-3p和PTEN mRNA的相對表達量，以U6或GAPDH作為內參基因。miR-489-3p引物序列：5’-GGGGTGACATCACATATAC-3’(正向)，5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’(反向)；U6引物序列：5’-CCTGCTTCGGCAGCACA-3’(正向)，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)；PTEN引物序列：5’-AAGACCATAACCCACCACAGC-3’(正向)，5’-ACCAGTTCGTCCCTTTCCAG-3’(反向)；GAPDH引物序列：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’(正向)，5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(反向)。

1.5.2 T24細胞增殖檢測：將轉染后的各組T24細胞制備成細胞懸液，接種至96孔細胞板上，培養至24、48、72 h時，分別加入MTT試劑(濃度為5 g/L)20 μl，4 h后利用酶標儀檢測450 nm處的光密度值(OD)。每組處理后的T24細胞(每孔1×103)置于10 cm培養皿中，培養2周，最后用1%結晶紫染色，計數細胞集落數(克隆數目)。

1.5.3 T24細胞侵襲檢測：Transwell法檢測細胞侵襲。將解凍后的基質膠與不含胎牛血清的RPMI1640培養基充分混合，然后平鋪在Transwell小室的上室，待其凝固后加入細胞懸液200 μl，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基600 μl，2 h后擦去未侵襲的細胞，采用多聚甲醛和結晶紫進行固定和染色，20 min后在顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照并計數。染色的細胞即為發生侵襲的細胞。

1.5.4 T24細胞凋亡檢測：按照Annexin-V/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明對轉染后的各組T24細胞進行處理，并使用流式細胞儀檢測其細胞凋亡率。

1.5.5 T24細胞中PTEN、PI3K、Akt蛋白表達檢測：采用Western-blot實驗檢測T24細胞中蛋白表達。提取轉染后各組T24細胞的總蛋白，將定量后的蛋白樣品進行電泳、轉膜、封閉、洗膜，然后加入PTEN、PI3K、Akt抗體，4℃培養過夜，洗滌后加入相應二抗，培養1 h，使用ECL化學發光系統檢測各組T24細胞的蛋白表達水平。

1.5.6 T24細胞的相對熒光素酶活性：將miR-489-3p mimics與miR-NC分別與構建好的WT-PTEN 3’UTR或MUT-PTEN 3’UTR載體質粒利用Lipofectamine 2000轉染試劑轉染至T24細胞中，共分成4組：miR-NC+WT-PTEN 3’UTR組、miR-489-3p mimics+WT-PTEN 3’UTR組、miR-NC+MUT-PTEN 3’UTR組和miR-489-3p mimics+MUT-PTEN 3’UTR組。培養48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組T24細胞的相對熒光素酶活性。為進一步驗證miR-489-3p與PTEN的作用關系，利用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-NC、miR-489-3p mimics、anti-miR-NC(抑制物陰性對照)、anti-miR-489-3p(抑制物)分別轉染至T24細胞中，并記為miR-NC組、miR-489-3p mimics組、anti-miR-NC組、anti-miR-489-3p組，48 h后收集各組細胞按照1.5.5的方法檢測PTEN蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1 差異miRNA的篩選 通過火山圖分析TGCA數據庫中BC組織中差異miRNA，篩選到miR-489-3p在BC組織中顯著下調，見圖1。

圖1 火山圖分析BC組織中的差異miRNA

2.2 BC組織和細胞系中miR-489-3p和PTEN mRNA表達水平比較 與癌旁組織比較，BC癌組織中miR-489-3p相對表達量下降，PTEN mRNA相對表達量上升(P<0.01)；與SV-HUC-1細胞比較，5637、J82、T24細胞中miR-489-3p相對表達量降低，PTEN mRNA相對表達量升高(P<0.05)，見表1。其中，T24細胞中miR-489-3p相對表達量最低，PTEN mRNA相對表達量最高，故選擇T24細胞進行轉染實驗。

表1 BC組織及細胞系中miR-489-3p和PTEN mRNA表達水平比較

2.3 miR-489-3p表達在BC患者不同臨床病理特征中比較 根據miR-489-3p的相對表達量均值分為低表達組(≤0.36)70例和高表達組(>0.36)40例，miR-489-3p低表達組患者TNM分期T3～4、有淋巴結轉移、腫瘤低分化比例高于高表達組(P<0.05)，而2組患者性別、年齡及遠處轉移比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同臨床病理特征BC患者中miR-489-3p表達比較 [例(%)]

2.4 miR-489-3p和PTEN的靶向關系 生物信息學網站預測結果顯示，miR-489-3p和PTEN 3’UTR有互補的結合位點，見圖2。miR-489-3p mimics+WT-PTEN 3’UTR組相對熒光素酶活性低于miR-NC+WT-PTEN 3’UTR組(P<0.05)；而與miR-NC+MUT-PTEN 3’UTR組比較，miR-489-3p mimics+MUT-PTEN 3’UTR組相對熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。另外，miR-489-3p mimics組PTEN蛋白表達水平低于miR-NC組，anti-miR-489-3p組PTEN蛋白表達水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)，見圖3、表4。

圖2 miR-489-3p和PTEN的結合位點

注：A.miR-NC組；B.miR-489-3p mimics組；C.anti-miR-NC組；D.anti-miR-489-3p組

2.5 各組T24細胞的增殖、侵襲、凋亡及PI3K、Akt蛋白表達比較 與對照組、miR-NC組比較，miR-489-3p mimics組PTEN蛋白表達水平降低，OD值(24 h、48 h、72 h)下降，克隆數目和細胞侵襲數減少，凋亡率和PI3K、Akt蛋白表達水平增高，差異均具有統計學意義(P<0.01)；與miR-489-3p mimics組、miR-489-3p mimics+pcDNA組比較，miR-489-3p mimics+pc-PTEN組PTEN蛋白表達水平升高，OD值(24 h、48 h、72 h)增加，克隆數目和細胞侵襲數增多，凋亡率和PI3K、Akt蛋白表達水平下降，差異均具有統計學意義(P<0.01)。見圖4、圖5、表5、表6。

表3 各組相對熒光素酶活性比較

表4 各組PTEN蛋白表達比較

圖4 各組T24細胞侵襲(結晶紫染色，×200)、凋亡情況比較

注：A.對照組；B.miR-NC組；C.miR-489-3p mimics組；D.miR-489-3p mimics+pcDNA組；E.miR-489-3p mimics+pc-PTEN組

表5 各組T24細胞PTEN蛋白表達及各時點OD值、克隆數目比較

表6 各組T24細胞侵襲數、凋亡率及PI3K、Akt蛋白表達比較

3 討 論

外科手術是治療BC的主要方法，但由于其術后復發率高，患者的生存率仍然較低[6]。因此，探究新的靶向藥物是BC臨床治療的重中之重。

國內外研究表明，miRNA與腫瘤細胞的生長、凋亡等聯系密切，可作為腫瘤早期診斷或預后標志物[7-8]，也可通過與靶基因結合發揮抑癌或抗癌作用[9-11]。本研究首先通過火山圖分析TGCA數據庫BC組織中差異miRNA，進而篩選到顯著下調的miR-489-3p。以往研究表明，miR-489-3p通過調控不同靶點抑制胰腺癌、膠質瘤、骨肉瘤細胞進展[12-14]，但是miR-489-3p在BC中的研究極少。本研究發現，miR-489-3p在BC組織和細胞系中的表達降低，與Li等[15]的研究結果一致。另外，本研究還發現，miR-489-3p低表達與BC患者的臨床分級明顯相關，說明miR-489-3p可能作為抑癌因子在BC中起作用。由于T24細胞中miR-489-3p相對表達量最低，因此選擇T24細胞進行轉染實驗。

進一步研究發現，miR-489-3p過表達抑制了T24細胞增殖和侵襲并誘導了細胞凋亡，這與miR-489-3p在其他癌細胞中的作用一致，進一步揭示了miR-489-3p在BC中的抗癌功能。然而，miR-489-3p調控BC細胞生物學行為的分子機制還不清楚，需進行更深一步的研究。

本研究通過生物信息學網站預測得知PTEN是miR-489-3p的潛在靶基因，并證實了miR-489-3p靶向負調控PTEN表達。PTEN是10q23.3染色體上的一種抑癌基因，具有雙重磷酸酶特性[16]。研究顯示，PTEN參與癌細胞的生長、轉移等過程[17-18]。本研究發現，PTEN在BC組織和細胞中上調，與Man等[19]的實驗結果一致，提示PTEN在BC中發揮促癌作用。此外，本研究還表明同時過表達miR-489-3p和PTEN后促進了T24細胞增殖和侵襲，阻礙了細胞凋亡，揭示miR-489-3p靶向PTEN調控BC細胞的增殖、侵襲和凋亡。

最近的研究顯示，PTEN能夠通過調控PI3K/Akt通路蛋白表達影響腫瘤細胞的發生、發展[20]。在BC細胞中，PTEN的激活可抑制PI3K、Akt蛋白表達[21]。大量文獻表明，PI3K/Akt通路參與調控BC在內的各種類型癌細胞的增殖、凋亡和侵襲，且PTEN與該通路呈負向調控的關系[21-24]。本研究也顯示，miR-489-3p過表達可提高PI3K、Akt蛋白表達，而過表達PTEN能夠逆轉上述蛋白表達水平及miR-489-3p過表達對T24細胞增殖、侵襲的阻滯和對凋亡的增強作用。說明miR-489-3p通過靶向抑制PTEN表達，激活PI3K/Akt信號通路，調控BC細胞的增殖、凋亡和侵襲。

綜上所述，miR-489-3p抑制BC細胞的增殖和侵襲、促進凋亡，其機制可能與靶向下調PTEN蛋白表達，激活PI3K/Akt信號通路有關。miR-489-3p可能作為分子標志物，為BC提供新的靶向治療思路。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王哲：研究構思，論文撰寫；張敬：課題設計；吳仁通：數據獲??；張潮：統計學分析；陳懷安：修改論文；苗文隆：論文終審