基于TLR4/NF-κB信號通路上調(diào)miR-143對顱內(nèi)動脈瘤模型大鼠的干預作用

楊成，張燕飛，管宏新，陳一鳴，魏亮，鐘春龍

臨床中將顱內(nèi)動脈血管先天異常等因素引發(fā)的局部血管壁損傷統(tǒng)稱為顱內(nèi)動脈瘤，受血流動力學負荷等因素影響，逐漸擴大形成異常膨出[1]。顱內(nèi)動脈瘤作為高致殘、致死的腦血管疾病對人類健康造成嚴重威脅。流行病學數(shù)據(jù)顯示，美國約有900萬顱內(nèi)動脈瘤患者，占總人口的3%，每年約有3萬人出現(xiàn)大腦蛛網(wǎng)膜下腔出血，其中40%是致命的；在中國，顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病率約為7%[2]。顱內(nèi)動脈瘤根據(jù)病因可分為動脈硬化性動脈瘤、感染性動脈瘤、外傷性動脈瘤、先天性動脈瘤等4種類型[3]。顱內(nèi)動脈瘤早期無癥狀，但隨著病情轉移、發(fā)展，會因瘤體破裂而導致出血，如果瘤體破裂出血，可導致嚴重的蛛網(wǎng)膜下腔出血，出現(xiàn)嚴重的頭痛、頸部僵硬、嘔吐、體溫升高等癥狀，甚至意識模糊或昏迷[4]。miRNA屬于高保守性、內(nèi)源性非編碼小RNA，主要由核內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ轉錄而成，在進行轉錄過程中能夠對機體內(nèi)30%的編碼基因進行調(diào)節(jié)。miR-143是人類5號常染色體編碼的miRNA，在血管平滑肌細胞中呈現(xiàn)高表達，能夠有效調(diào)控平滑肌細胞表型，這一生物學反應能夠促進顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生發(fā)展，與顱內(nèi)動脈瘤之間具有緊密關聯(lián)[5]。因此，本研究旨在探究上調(diào)miR-143對顱內(nèi)動脈瘤模型大鼠的干預作用及作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1) 動物：SPF級SD大鼠60只，購自河南中醫(yī)藥大學[許可證號：SYXK(豫)2020-0004)]，雌雄各半，月齡4～7(5.23±1.42)個月，體質(zhì)量250～305(263.63±26.12)g，光照12 h/d，在濕度24%～32%、溫度為(26.6±3.8)℃的環(huán)境下喂養(yǎng)1周。(2)試藥試劑：0.12%β-氨基丙腈、miR-143購自美國西格瑪—奧德里奇公司；轉化生長因子β1(TGF-β1) ELISA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒購自武漢伊萊特生物科技股份有限公司；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒購自上海彩佑實業(yè)有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)ELISA試劑盒購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；MMP-9 ELISA試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司；TLR4抗體、Caspase-3抗體購自武漢益普生物科技有限公司，NF-κB抗體購自上海雅吉生物科技有限公司。(3)儀器設備：顯微鏡、離子濺射儀、冰箱購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 實驗方法 2020年12月—2021年9月在同濟大學附屬東方醫(yī)院實驗室進行實驗，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。參考文獻[6]建立顱內(nèi)動脈瘤大鼠模型。將60只大鼠隨機分為空白組、模型組、上調(diào)組和下調(diào)組，各15只。除空白組外，其余大鼠構建顱內(nèi)動脈瘤模型：腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，取仰臥位，消毒后沿頸部正中縱向切開1.5 cm，顯微鏡下分離左側頸總動脈和頸外動脈，使用8-0尼龍線依次結扎左側頸外動脈、左側翼腭動脈及右側頸總動脈，最后逐層縫合。空白組：僅手術暴露血管但不結扎。通過電鏡判斷大鼠前交通動脈復合體的成瘤情況來判斷建模是否成功，根據(jù)血管形態(tài)判斷瘤樣改變程度，共分4級：0級為血管管徑正常光滑；1級為血管管徑增大或出現(xiàn)粗糙樣改變；2級為血管出現(xiàn)不規(guī)則印記或局部出現(xiàn)淺梭形抬高；3級為血管上可觀察到囊狀動脈瘤或血管局部存在動脈瘤樣擴張。其中1～3級為造模成功。構建miR-143慢病毒載體：于建模成功后立即給予干預，上調(diào)組大鼠尾部注射30 mg/kg ago miR-143，下調(diào)組大鼠尾部注射30 mg/kg antago miR-143，正常組、模型組大鼠尾部注射等劑量生理鹽水。模型組另給予miR-143空載質(zhì)粒(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所)，均連續(xù)給藥7 d,做慢病毒滴度測定[病毒滴度為1×109轉導單位(TU)/ml)]。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 細胞轉染：取對數(shù)生長期的腦動脈瘤組織細胞(購自于上海佰曄生物公司)，將其分為空白組(不做任何處理的腦動脈瘤組織細胞)、上調(diào)組(腦動脈瘤組織細胞+miR-143 mimics)、下調(diào)組(腦動脈瘤組織細胞+miR-143 inhibitor)，將100 μl 1×105個/ml細胞濃度的細胞懸液加入各組且設置2個復孔，當細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，空白組加入常規(guī)細胞培養(yǎng)液做空白處理，上調(diào)組、下調(diào)組分別加入miR-143 mimics、Lipofectamine 2000試劑行上調(diào)轉染，miR-143 inhibitor、Lipofectamine 2000試劑行下調(diào)轉染。

1.3.2 miR-143基因表達檢測：在建模完成后3 d做miR-143轉染，大鼠45只以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定，手術區(qū)域酒精消毒。分離并結扎腎動脈后支，同理結扎右側，取腹部正中切口，暴露膀胱，確定卵巢，結扎，逐層縫合皮膚關腹；手術完成后給予大鼠0.9%氯化鈉溶液、0.12%β-氨基丙腈飼養(yǎng)，最后鑒定轉染效率：Treg細胞總RNA、所提取的RNA濃度、完整性采用比色法測定，使用多基因梯度做實時熒光定量PCR(qRT-PCR)鑒定miR-143轉染效率，引物由北京天根生化科技有限公司合成。反應過程為75 ℃預變性120 s，90 ℃變性5 min，60 ℃、60 s退火，72 ℃、30 s延伸，共行40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，采用2-△△CT表示結果。β-actin上游引物:5'-TGACCCAGATCATGTTTG-3'，下游引物:5'-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3'；miR-143上游引物:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCA-GAGAT-3'，

下游引物:5'-ACACTCCAGCTGGGGGTGCAGTGCTGCAT-3'。

1.3.3 血清TGF-β1、TNF-α、VEGF、MMP-2、MMP-9水平檢測：60只大鼠分別采集血樣本2 ml，靜置1 h，離心取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清TGF-β1、TNF-α、VEGF、MMP-2、MMP-9。酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。

1.3.4 TLR4、NF-κB、Caspase-3蛋白檢測：采用Western blot法檢測。取待檢大鼠顱內(nèi)動脈組織蛋白加入RIPA裂解液裂解、勻漿，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(TLR4抗體、NF-κB抗體、Caspase-3抗體，1∶1 000)，過夜孵育。加入二抗(山羊抗兔IgG，1∶5 000)孵育2 h，顯影、定影、沖洗、晾干，掃描膠片，采用Image J軟件分析TLR4、NF-κB、Caspase-3表達，以β-actin為內(nèi)參，目標蛋白水平=目標條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結 果

2.1 各組miR-143基因表達比較 miR-143基因表達量模型組(3.26±1.02)>空白組(1.20±0.31)，下調(diào)組(5.13±1.21)>模型組>上調(diào)組(2.42±0.58)，差異均有統(tǒng)計學意義(F/P=7.484/0.001)。

2.2 各組大鼠動脈壁病理組織學觀察 空白組大鼠動脈壁組織細胞呈線性排列，血管內(nèi)膜完整；模型組動脈壁平滑肌排列較為紊亂，血管壁厚度不均勻，血管壁呈現(xiàn)膠原化；下調(diào)組大鼠動脈壁血管壁局部變得較薄；上調(diào)組平滑肌細胞紊亂減輕，血管壁局部增厚，見圖1。

圖1 各組大鼠動脈壁病理表現(xiàn)(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠顱內(nèi)動脈瘤成瘤比較 空白組大鼠腦動脈瘤瘤樣較輕；模型組動脈瘤瘤樣改變，動脈淺梭行抬高；下調(diào)組動脈瘤瘤樣改變嚴重，動脈瘤樣擴張嚴重，動脈淺梭行明顯抬高；上調(diào)組前交通復合體動脈瘤瘤樣與空白組比較差異不大，部分動脈管徑均勻迂曲擴張，見圖2。

圖2 各組大鼠顱內(nèi)動脈瘤電鏡觀察(×2 000)

2.4 各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、VEGF水平比較 模型組血清TGF-β1、TNF-α、VEGF水平明顯高于空白組，TGF-β1、TNF-α、VEGF水平下調(diào)組>模型組>上調(diào)組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠血清TGF-β1、TNF-α、VEGF水平比較

2.5 各組大鼠血清MMP-2、MMP-9水平比較 模型組血清MMP-2、MMP-9水平明顯高于空白組，而下調(diào)組>模型組>上調(diào)組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血清MMP-2、MMP-9水平比較

2.6 各組大鼠TLR4/NF-κB信號通路蛋白基因表達量比較 模型組TLR4、NF-κB、Caspase-3表達量高于空白組，而下調(diào)組>模型組>上調(diào)組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3、表3。

圖3 各組大鼠細胞TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達比較

表3 大鼠顱內(nèi)動脈瘤TLR4/NF-κB信號通路蛋白基因表達量比較

3 討 論

顱內(nèi)動脈瘤是引起蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要原因，在臨床腦血管意外中，僅次于高血壓腦出血、腦栓塞，位居第三位，任何年齡都可發(fā)生，而多數(shù)為40～60歲的中老年婦女[7]，臨床強調(diào)早診斷、早治療[8]。

目前顱內(nèi)動脈瘤的病因尚不清楚，有學者認為顱內(nèi)動脈瘤的出現(xiàn)是由顱內(nèi)動脈壁的局部先天缺陷和腔內(nèi)壓力增加所導致[9]。顱內(nèi)動脈瘤多發(fā)生在Willis環(huán)內(nèi)，80%發(fā)生在Willis環(huán)的前半段。本結果顯示，上調(diào)miR-143可有效抑制顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生發(fā)展，為腦動脈瘤的預后提供重要的臨床理論依據(jù)。

研究表明，miR-143對平滑肌細胞的表型有著較強的調(diào)控作用。馮明陶[10]研究顯示，在動脈瘤形成過程中，顱內(nèi)Willis環(huán)miR-143表達下降，分泌型平滑肌細胞表達上升。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-143基因在顱內(nèi)動脈瘤大鼠中表達量顯著上升，表明miR-143可能參與顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。

TGF-β1為具有雙向調(diào)節(jié)性的高分子多肽，是參與細胞增殖分化的主要調(diào)控因子。TGF-β1來源較廣，并以二聚體的形式發(fā)揮作用。TGF-β1是由2個潛在的相關多肽結合蛋白結合形成[11]。TNF-α能夠通過維持炎性反應，削弱血管壁結構，進而導致顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生[12-15]。VEGF參與了血管內(nèi)皮細胞轉移、增殖，參與炎性浸潤、心血管生成等，也參與血管通透性的增加、細胞增殖、遷移、基質(zhì)的變性等反應，不同類型的VEGF有不同作用機制[16-18]。本結果顯示，下調(diào)組血清TGF-β1、TNF-α、VEGF水平明顯高于上調(diào)組，說明TGF-β1、TNF-α、VEGF降低可有效保護大鼠腦組織，使內(nèi)皮細胞的通透性降低。其水平升高能夠抑制相關細胞的增殖遷移。

MMPs是一個擁有20多個成員的大家庭，主要分為基質(zhì)溶酶、明膠酶﹑膜蛋白酶等。MMPs能夠降解幾乎所有細胞外基質(zhì)成分。MMP-2和MMP-9在動脈瘤形成中的作用越來越受到關注，腦動脈瘤血管壁重構過程中的重要改變是內(nèi)皮細胞的丟失、細胞外基質(zhì)的重構[19-21]。當MMPs在傷口愈合、炎性反應、惡性腫瘤發(fā)生時迅速上升，當MMP-2、MMP-9失調(diào)，可導致血管壁基質(zhì)的破壞和動脈瘤形成[22-23]。本結果顯示，下調(diào)組MMP-2、MMP-9水平明顯高于上調(diào)組，說明MMP-2、MMP-9對顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)展發(fā)生起到一定的延緩、預防作用。

NF-κB活化后不僅可以調(diào)節(jié)免疫反應中的基因,還可以上調(diào)炎性相關基因的表達。研究顯示,TLR2、3、4、9參與了肺中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性病變,其中TLR4信號傳導通路能夠在卒中、蛛網(wǎng)膜下腔出血后急性炎性腦損害中發(fā)揮主要作用[24]。本研究說明TLR4/NF-κB信號通路在應激性疾病發(fā)病機制中起到重要作用，通過上調(diào)NF-κB和TLR4達到抗顱內(nèi)動脈瘤的效果，在應激狀態(tài)下TLR4/NF-κB信號通路受到抑制,TLR4/NF-κB表達量明顯降低。

綜上所述，上調(diào)miR-143基因可作用于TLR4/NF-κB信號通路，有效抑制顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)生發(fā)展，miR-143可以成為顱內(nèi)動脈瘤診斷和病情判斷的分子標志物。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊成、魏亮：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫、修改；張燕飛：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù);管宏新、陳一鳴：實施研究過程，資料搜集整理，進行統(tǒng)計學分析，論文撰寫;鐘春龍：課題設計，論文審核