基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-3、基質金屬蛋白酶-9主要基因位點多態性與缺血性腦血管病的相關性分析

黃奕平，俞 敏，張麗君

(深圳市龍崗中心醫院神經內科，廣東 深圳 518000)

腦血管病具有較高的發病率、致殘率以及致死率，是導致人類死亡的第二大原因，據不完全統計數據顯示，2015年因腦血管疾病死亡的人數已突破650萬，預計到2030年死亡率可能突破780萬[1-2]。受人口老齡化的影響，腦血管病的發病人數與日俱增，嚴重威脅人類的生命安全，已受到廣大醫務工作者的共同關注。且隨著近年來相關研究的不斷深入，越來越多的學者發現基質金屬蛋白酶(MMPs)可能在腦血管病的發生、發展過程中起著至關重要的作用[3]。MMPs主要是指以組含有可降解細胞外基質的蛋白酶，目前主要是按照結構以及底物特異性的差異將其分作明膠酶(如MMP-2與MMP-9)，基質溶解素(如MMP-3與MMP-7)，間質膠原酶(如MMP-1與MM-2)等[4]。且有研究報道顯示：MMPs會對血管基質產生嚴重損害，繼而干擾腦血管的完整性，同時對血腦屏障造成損傷，可能加劇腦損傷的發生[5]。鑒于此，本文通過研究MMP-1、MMP-3、MMP-9主要基因位點多態性與缺血性腦血管病的相關性，旨在為腦血管病的治療尋求新的靶點，并為腦血管病患者的預后及生活質量改善提供參考依據，進一步減少社會對腦血管病治療所支出的巨大醫療成本。

1 對象與方法

1.1一般資料：選取2016年7月～2020年10月我院收治的短暫性腦缺血發作(TIA)患者100例以及急性腦卒中患者100例作為研究對象，分別作為TIA組以及卒中組。另選取同期體檢的健康志愿者100例作為對照組。TIA組男63例，女37例；年齡34～78歲，平均(58.93±3.55)歲；體重指數(BMI)19～28 kg/m2，平均(22.52±2.10)kg/m2；基礎疾病：高血壓71例，糖尿病56例；吸煙58例，飲酒40例。入選標準[6]：①均經相關檢查確診為TIA；②年齡均已超過40歲；③并無其他腦血管病；④無惡性腫瘤或(和)自身免疫性疾病。TIA判定標準：局灶性腦功能損害癥狀和體征在24 h內(多數1 h內)完全恢復；急性發作性病程(多在2～3 min)；符合TIA發作時神經系統的癥狀和體征。卒中組男65例，女35例；年齡33～79歲，平均(58.84±3.56)歲；BMI 20～28 kg/m2，平均(22.59±2.15)kg/m2；基礎疾病：高血壓72例，糖尿病53例；吸煙55例，飲酒41例。入選標準：①均為急性發作；②病程不足2周；③頭顱CT、MRI確診；④以往未發生過腦血管病；⑤年齡均已超過40歲；⑥無惡性腫瘤或(和)自身免疫性疾病。對照組男67例，女33例；年齡32～79歲，平均(58.89±3.59)歲；BMI 20～28 kg/m2，平均(22.61±2.13)kg/m2；基礎疾病：高血壓69例，糖尿病51例；吸煙54例，飲酒42例。入選標準：①年齡均已超過40歲；②無腦血管病或惡性腫瘤或其他自身免疫性疾病等。兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2研究方法：①血清MMP-1、MMP-3、MMP-9及Vaspin、Chemerin水平水平檢測：血液標本采集時機選擇為清晨空腹狀態，采集靜脈血量為3 ml，實施時長為10 min的3 000r/min離心處理，獲取血清保存備用。通過酶聯免疫吸附法完成上述各項血清學指標水平的檢測，具體操作務必遵循試劑盒說明書進行。試劑盒均由深圳晶美生物科技有限公司提供。②基因位點測定：MMP-1基因型檢測：基因位點為C-161T，基因型包括C/C(野生純合子)、C/T(突變雜合子)、T/T(突變純合子)。第一步即以酚-氯仿抽提法自外周血有核細胞內提取基因組DNA，隨后完成PCR擴增PPAR-γ2基因Pro12Ala多態性片段操作。上、下游引物序列分別為5'-CAAGCCCAG TCCTTTCTGTG-3'、5'-AGTGAAGGAATCGC TTTCCG-3'。反應參數：95℃預變性5 min，95℃變性45 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環，末次循環72℃ 7 min。反應在PCR擴增儀上完成(購自美國Bio-Rad)。然后以PCR-RFLP法完成多態性的檢測，純化處理PCR產物后經限制性內切酶HpaⅡ(購自美國Promegar公司)酶切，酶切位點為C/C GG。37℃水浴酶解4 h，經8%非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳，EB染色后讀取基因型;MMP-3基因型檢測：基因位點為rs3025058，基因型包括5A純合子、6A純合子以及5A/6A雜合子。基因檢測方式與MMP-1基因相同，上、下游引物序列分別為5'-CTTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCACT-3'、5'-TTCCCCCATEAAAGGAATGGAGAACC-3';MMP-9基因型檢測：基因位點為SNP rs 3918242，基因型包括C/C純合子、T/T純合子以及T/C雜合子。基因檢測方式與MMP-1基因相同，上、下游引物分別為5'-GCCTGGCACATAGATGGCCC-3'、5'-CTTCCTAGCCAGCCGGCATA-3'。③血清Vaspin及Chemerin水平檢測。

1.3觀察指標：比較三組血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平和基因型情況；分析血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平診斷TIA效能的受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結果

2.1三組血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平評價：TIA組血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水分別為(122.34±8.15)μg/L、(93.21±8.03)μg/L、(132.74±8.37)μg/L，明顯高于卒中組的(86.83±6.29)μg/L、(57.22±5.71)μg/L、(110.42±5.23)μg/L，且卒中組上述各項指標水平均高于對照組差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平評價

2.2血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平診斷TIA效能的ROC曲線分析：血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平聯合診斷TIA的曲線下面積、敏感性及特異性均高于上述三項指標單獨檢測。見表2。

表2 血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平診斷TIA效能的ROC曲線分析

2.3三組MMP-1、MMP-3及MMP-9基因型情況評價：TIA與卒中組MMP-1/C-161T基因型CC人數占比相較于對照組顯著更高，而CT、TT人數占比相較于對照組明顯更低差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 三組MMP-1、MMP-3及MMP-9基因型情況評價[n(%)，n=100]

2.4三組血清Vaspin及Chemerin水平對比：TIA組、卒中組血清Vaspin水平均低于對照組，且TIA組血清Vaspin水平低于卒中組；TIA組、卒中組血清Chemerin水平均高于對照組，且TIA組血清Chemerin水平高于卒中組差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 三組血清Vaspin及Chemerin水平對比

3 討論

TIA和腦卒中是臨床上較為常見的神經系統疾病，具有發病率高、致殘率高以及致死率高的特點，根本病因為腦部血氧供應缺乏[8-9]。相關研究報道證實，該類患者存在一定程度的腦組織局部動脈血流減少，因此腦組織往往發生缺血、缺氧，繼而導致神經功能出現損傷，預后不良[10-12]。相關研究報道顯示，早期預測TIA及腦卒中是改善患者預后的關鍵，亦是目前臨床醫務人員共同關注的熱點[13-15]。迄今為止，臨床上針對腦血管病的影像學檢查手段包括超聲、磁共振成像以及CT等，患者一旦發生明確的影像學變化，往往提示腦血管狀況較差，預后不良。由此可見，尋求一種更為積極、有效的缺血性腦血管病早期診斷方式顯得尤為重要，亦是目前臨床研究的熱點。

MMP-1相較于MMPs家族其他成員而言，具有較高的表達，主要作用是對人體內豐富的Ⅰ型、Ⅲ型膠原組織起到明顯的降解作用，可能參與了腦血管病的發病過程，并在其中發揮著至關重要的作用[16]。MMP-3是MMPs家族中另一重要酶，主要是通過影響其他MMPs活性以及功能的途徑，進一步介導腦血管病的發生、發展。臨床一項關于MMP-3單核苷酸多態性的研究證實[17]，SNP和冠狀動脈粥樣硬化程度以及心肌梗死的風險性密切相關。且體內外的試驗結果證實[18]：MMP-3在血管組織內高表達于5A純合子，低表達于6A純合子，且5A純合子人群相較于6A純合子人群而言，動脈粥樣硬化程度顯著增加。MMP-9則是目前國內外研究最多的一種MMPs，已被證實其活性和單核苷酸多態性不但和腦血管疾病的發生、發展存在密切相關，亦和全身動脈硬化有一定聯系。本研究發現，TIA患者血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平存在明顯高表達，且聯合檢測上述三項血清學指標水平診斷TIA的效能較高。究其原因可能是MMPs可對血管基質造成一定程度的破壞，同時影響腦血管的完整性，損傷血腦屏障，繼而引起腦損傷的加劇。張麗君等人已得到與本研究相似結果[19]：TIA患者以及腦卒中患者的血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平均明顯高于健康人群，且TIA患者的上述各項指標水平均高于腦卒中患者。此外，本研究發現MMP-1基因多態性可能和缺血性腦血管病密切相關，但MMP-3及MMP-9基因多態性和缺血性腦血管病無關。考慮原因可能是MMP-1/C-161T基因會促進動脈粥樣硬化過早進入不穩定狀態，進一步促進了缺血性腦血管病的發生、發展。這在俞敏等人的研究報道中得以佐證[20]：MMP-1基因多態性可能和缺血性腦血管疾病有關。本文結果還顯示，TIA組、卒中組血清Vaspin水平均低于對照組，且TIA組血清Vaspin水平低于卒中組；TIA組、卒中組血清Chemerin水平均高于對照組，且TIA組血清Chemerin水平高于卒中組。Vaspin可通過調節磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號通路，繼而減少有利脂肪酸誘導的內皮細胞凋亡，同時抑制P34/hap27信號通路，減少活性氧產生，從而抑制血小板原生長因子所引起的平滑肌細胞遷移，進一步抑制疾病的發生、發展。Chemerin屬于機體內的關鍵性代謝性影響因子，其異常表達可通過影響脂質代謝紊亂，繼而增加低密度脂蛋白對動脈血管內皮細胞的浸潤，進一步導致粥樣硬化或動脈關閉狹窄發生。

綜上所述，血清MMP-1、MMP-3及MMP-9水平聯合檢測可用作TIA的臨床診斷，且MMP-1基因多態性可能和缺血性腦血管病密切相關，而MMP-3及MMP-9基因多態性和缺血性腦血管病無關。此外，血清Vaspin、Chemerin表達的異常可能在缺血性腦血管病發生、發展過程中發揮至關重要的作用，其具體作用機制有待進一步研究證實。