加味芩桂術湯聯合奧氮平對糖尿病大鼠心肌纖維化及核因子κB、結締組織生長因子表達的影響

蔡素華，任禮錫

(廣州中醫藥大學金沙洲醫院藥學部，廣東 廣州 510168)

糖尿病心肌病屬于糖尿病患者常見并發癥之一，疾病發病因素上，細胞學病變以及心肌細胞間纖維沉積屬于引起心臟舒張功能損傷，糖尿病心肌病的關鍵因素[1]。核因子κB(NF-κB)幾乎可以在所有的動物細胞中發現，主要是參加細胞對外界刺激的響應，在細胞炎性反應以及免疫應答過程中起到關鍵性作用，若NF-κB錯誤常容易引起自身免疫疾病[2]。結締組織生長因子(CTGF)則是近年來新發現的一種致纖維化生長因子，屬于多組織器官纖維化形成過程的重要介質。對糖尿病的患者，顯示奧氮平除了具有顯著抗精神病的作用，而且有潛在的器官保護作用[3]。加味芩桂術湯是一種活血寧心、健脾利濕及溫陽化飲的治療藥物，可降低肺動脈高壓及改善心功能，而對于應用加味芩桂術湯聯合奧氮平對延緩糖尿病心肌病的相關機制卻有待進一步的研究[4]。本次研究中，建立了糖尿病大鼠模型，分析了應用加味芩桂術湯聯合奧氮平對大鼠心肌纖維化、NF-κB以及CTGF表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料:選擇70只雄性Wistar大鼠，均由南京軍區總院實驗動物中心提供。對所有的大鼠均是建立模型，主要是給予大鼠進行10h的禁食，然后單次經腹腔內注入用0.1%mmol/L無菌檸檬酸緩沖液配制的STZ給予單次腹腔注射，注射量為50 mg/kg。注射藥物72 h后取尾靜脈進行血糖的測定，測定血糖水平≥16.7 mmol/L及選取為糖尿病大鼠。將大鼠分成四組，即正常對照組(n=10)，糖尿病大鼠分成模型組(n=20)、奧氮平組(n=20)、加味芩桂術湯聯合奧氮平組(n=20)。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2試劑:美國Sigma公司生產的鏈脲佐菌素；武漢博士德公司生產的NF-κB多克隆抗體；美國Bi Vision公司生產的CTGF多克隆抗體；申能博才生化公司生產的蛋白提取試劑盒。

1.3用藥方法:正常對照組給予注射等量檸檬酸緩沖液；模型組每天予以同體積生理鹽水灌胃；奧氮平組每天以5 mg/kg灌胃；加味芩桂術湯聯合奧氮平組每天以5 mg/kg奧氮平聯合5 mg/kg加味芩桂術湯灌胃(基礎組方：丹參、黃芪、茯苓各30 g，葶藶子、白術、桂枝各15 g，桔梗、陳皮、大腹皮、川芎各10 g，酒軍、麻黃各8 g，甘草6 g。辨證加減，對紫紺嚴重者加澤蘭20 g；氣虛乏力者加人參10 g；腹脹納差者加厚樸15 g；痰多咯痰不爽者加萊菔子5 g、枳實5 g、半夏5 g。藥物加水濃煎后裝袋)。各組小鼠用藥時間均是12周，在整個實驗期間所有的大鼠均予以標準飲食喂養，避免應用胰島素。

1.4觀察指標:所有的大鼠均在用藥12周后稱重，然后將大鼠處死并且收集3 ml的腹主靜脈血液，檢測血糖以及糖化血紅蛋白水平，打開大鼠胸腔并迅速取出心臟，應用冰鹽水沖洗及剝離，濾干水分并且置于電子天平上稱重。①心肌纖維化：主要觀察心肌超微結構，主要是采取電鏡檢查，選擇規格為1 mm3大小心室肌組織，置入到3%的戊二醛中進行固定，之后用1%餓酸固定1 h，丙酮逐級脫水，然后應用透射電鏡進行觀察。②NF-κB檢測：常規制作石蠟切片，按規范程序脫蠟，應用3% H2O2做滅活處理，微波抗原修復及BSA封閉液封閉，加NF-κB多克隆抗體，置入冰箱中過夜并加羊抗兔IgG，加入酶標記物及進行DAB顯色，脫水后封片。借助Leica圖像系統，在光學顯微鏡的幫助下放大400倍，每一張切片均隨機選擇5個視野獲取圖像，應用圖像分析系統計算各圖像吸光度值，吸光度值(D)=陽性區域總面積×陽性區域平均吸光度，5個視野圖像均值為各切片D值。③CTGF：選取大約100 mg心肌組織應用冰冷PBS連續漂洗2次，眼科剪碎并置入勻漿器，即刻加蛋白提取緩沖液，高速組織勻漿，冰上靜止30 min，經12 000次/min的速度持續離心10 min，選取上清液做蛋白定量測定，電泳、變性及電轉膜，CTGF抗體進行Western印跡分析，借助DAB顯影方式，借助生物凝膠圖像分析系統掃描定量總半定量分析。

2 結果

2.1心肌纖維化:電鏡下觀察模型組的大鼠在心肌間質內部可見大量的膠原纖維分布，心肌細胞排列紊亂并且肌原纖維呈現灶性溶解，肌絲扭曲且斷裂，線粒體明顯腫脹及增多。奧氮平大鼠左室心肌組織改變較模型組輕，細胞排列比較整齊，可見T管系統略微擴張，線粒體大小比較一致及排列規整，間質內膠原堆積減少。加味芩桂術湯聯合奧氮平組大鼠左室心肌細胞改變較奧氮平組明顯減輕，細胞排列整齊，肌原纖維斷裂，T管系統未見擴張。

2.2NF-κB、CTGF表達:在各組大鼠的NF-κB、CTGF表達情況上，模型組>奧氮平組>加味芩桂術湯聯合奧氮平組>正常對照組，兩兩組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠NF-κB、CTGF表達情況比較

3 討論

糖尿病是一種常見的慢性疾病，隨著生活方式及飲食方式的改變，疾病發病率不斷升高，這嚴重影響患者生活質量及威脅生命健康[5]。糖尿病的典型表現為高血糖，若持續處在高血糖狀態可增加各種心血管事件的發生率，因此研究糖尿病與心肌指標的聯系對于疾病的治療有積極意義[6]。

本次研究中，納入了大鼠作為研究資料，對大鼠分成非糖尿病及糖尿病，并且糖尿病大鼠也根據治療方式不同分成了三組。結果顯示在心肌纖維化上，經12周的治療后，同模型組的大鼠進行對比，奧氮平組、加味芩桂術湯聯合奧氮平組均在電鏡下可見間質纖維化減輕，心肌纖維排列整齊，線粒體水腫明顯減輕，且以聯合治療的小鼠改變明顯。說明加味芩桂術湯聯合奧氮平可改善糖尿病心肌纖維化情況，推測可能是來訥河藥物具有減輕膠原聚集作用。加味芩桂術湯中的主要功效是活血寧心、健脾利濕及溫陽化飲等，對其中的一些藥物經現代藥理學研究也顯示應用黃芪可以促進慢性肺心病的T細胞功能，降低肺動脈壓及減輕右心前負荷，川芎有助于松弛血管平滑肌及擴張肺血管，降低肺動脈高壓[7]。此外本次研究結果也顯示，經過12周的干預治療后，加味芩桂術湯聯合奧氮平組在NF-κB、CTGF表達水平上明顯比模型組與奧氮平組更低，數值同未建立糖尿病模型的正常對照組一致率高，推測原因是應用加味芩桂術湯聯合奧氮平的方式可以有效調節NF-κB，以直接或者是間接方式對下游的靶基因如CTGF等細胞因子進行抑制，從而起到有效抵抗心肌纖維化的作用[8]。加味芩桂術湯的用藥上，經現代藥理研究證實促血管緊張的方式，調節CTGF的活性，抑制大鼠CTGF表達及改善大鼠心肌纖維化，延緩疾病心肌病變的持續進展。

綜上所述，對于糖尿病大鼠，使用加味芩桂術湯聯合奧氮平的給藥治療方式，可以通過有效調節心肌NF-κB、CTGF表達的作用，有效改善心肌纖維化，減輕心臟負擔，如此可為糖尿病心肌病變治療提供可靠依據及參考。