基于生物信息學鑒定膝關節骨性關節炎滑膜炎性反應的關鍵基因和通路

陳 鵬，趙 超，胡 珍，陳繼明

(1.江西省都昌縣中醫院，江西 九江 332600；2.江西省都昌縣人民醫院，江西 九江 332600)

膝骨關節炎(KOA)是最常見的骨關節退行性病變，主要病理表現為軟骨退變、滑膜炎性反應及軟骨下硬化和骨贅形成[1-3]。據報道全球約有2.4億人患有KOA[4]。軟骨損傷被認為是導致KOA進展的關鍵病理因素[5]。但是，隨著醫學的飛速發展，人們越來越認識到滑膜炎性反應在KOA發病中的關鍵作用[6-8]。 Mancarella等[7]提出滑膜炎性反應驅動了KOA病理過程中的軟骨損傷。同時，許多臨床研究表明，滑膜炎性反應與KOA癥狀如關節疼痛、僵硬和軟骨損傷顯著相關[9-10]。因此，了解滑膜炎性反應的病理過程在KOA的治療中有重要作用。

隨著現代生物醫學的發展，越來越多的證據表明KOA的發生和發展是由多種基因和信號通路介導的。在過去的十年中，高通量技術已經報道了有關KOA基因表達譜研究的大量數據，并揭示了許多差異表達基因(DEG)涉及不同的途徑，生物過程(BP)或分子功能(MF)[11]。生物信息學方法可以整合多個基因表達譜的數據，使人們能夠研究KOA中mRNA表達的變化以及DEG之間的相互作用，從而為進一步的KOA研究提供了新的見識。因此，本研究旨在通過生物信息學分析法鑒定KOA滑膜組織中涉及的生物標志物和通路，在分子水平上為KOA進展提供新的見解。

1 資料與方法

1.1數據集下載：在Gene Expression Omnibus(GEO)數據庫中以'knee osteoarthritis'為檢索詞檢索KOA滑膜組織的測序數據集，得到GSE55235和GSE55457兩個基因表達數據集，兩個數據集均使用GPL96平臺處理。GSE55235和GSE55457共含有40個滑膜組織，包括健康關節的20個滑膜組織和KOA關節的20個滑膜組織。兩個數據集的詳細信息可見表1。

1.2DEG的篩選和鑒定：使用R軟件中的RPA[12]和sva軟件包[13]避免批次效應，通過ggpolt2軟件包[14]進行箱形圖驗證了兩個數據集的規范化。使用limma軟件包[15]分析確定DEG，以| log2(倍數變化)|>1和P<0.05為差異具有統計學意義的DEG。使用火山圖和熱圖顯示具有統計學意義的DEG。 使用R軟件中的ggplot2和pheatmap軟件包[16]生成火山圖和熱圖，顯示具有統計學意義的DEG。

1.3功能和途徑富集分析：GO富集分析[17]從三個方面來描述基因功能和關系的概念，即BP，細胞組分(CC)和MF。使用DAVID數據庫[18]對DEG進行GO和KEGG通路富集分析，然后使用R軟件進行可視化。P<0.05為差異具有統計學意義。

1.4蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡的構建和模塊分析：使用STRING數據庫[19]構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡。選擇相互作用評分>0.4的DEG在Cytoscape軟件中進行可視化。使用MCODE插件進行子模塊分析，以鑒定更多連接的基因組[20]。標準設置如下：MCODE分值>5，節點數>6。并同時對子模塊進行功能和通路富集分析。P<0.05為差異具有統計學意義。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

2 結果

2.1數據集的歸一化：GSE55235和GSE55457均從GEO數據庫下載的，并使用RPA和sva軟件包用于規范化數據并避免批處理效應。見圖1A所示，方框圖顯示的黑線基本處于同一水平；主成分分析(PCA)顯示，對照組和OA組存在明顯的聚類，各組之間存在顯著差異。見圖1B。

注：A為對DEG進行歸一化后的箱線圖，黑線所示的箱線圖基本處于同一水平，這表明兩個數據集的患者是統一且可比的，兩者之間的偏差很小；B為所有納入樣本的主成分分析(PCA)，在對照組和OA組中均顯示出明顯的簇，兩組之間存在顯著差異

2.2鑒定具有統計意義的DEG：使用limma軟件包對比正常組與OA組滑膜組織中的DEG。見圖2所示，總共觀察到279個DEG，包括133個基因被上調和146個基因被下調。圖3顯示了所有上調和下調的DEG的熱圖。

注：紅點表示上調的基因，藍點表示下調的基因，黑點表示無統計學差異的基因

注：紅色表示較高的基因表達，藍色表示較低的基因表達

2.3DEG的GO和KEGG通路富集分析：見圖4所示，GO富集分析結果顯示，在生物學過程(GO-BP)上，DEGs主要富集在“免疫反應”，“細胞黏附”和“炎性反應”等；在分子功能(GO-MF)上，DEG主要通過調節“肝素結合”，“絲氨酸型內肽酶活性”和“抗原結合”發揮分子功能；在細胞組分上，DEG主要在“細胞外囊泡”，“細胞外區域”和“細胞外空間”中顯著富集。

圖4 DEG的前10個GO富集結果

DEG的KEGG通路富集分析結果見圖5所示，提示DEGs主要通過“類風濕性關節炎”，“TNF信號傳導途徑”，“破骨細胞分化”和“ECM-受體相互作用”等途徑發揮重要作用。

圖5 DEG的前20條KEGG通路富集分析結果

2.4PPI網絡構建和hub基因篩選：使用STRING數據庫構PPI網絡，并選擇相互作用評分>0.4的具有統計學意義的DEG在Cytoscape軟件中進行可視化處理，見圖6。排名前20位的hub基因包括細胞白介素(IL)-6，原始原癌基因(JUN)，CXC基序趨化因子配8(CXCL8)，血管內皮生長因子A(VEGFA)，核因子κB抑制劑α(NFKBIA)，基質金屬蛋白酶(MMP)1，MMP9等。表1列出了前20個hub基因的詳細信息。在這些基因中，IL-6，JUN和VEGFA具有最高的節點度，表明其在滑膜炎性反應過程中起關鍵作用。

表1 前20個hub基因的詳細信息

紅色表示較高程度的基因，黃色表示較低程度的基因

2.5子模塊分析:在PPI網絡中共鑒定出兩個MCODE分值>5且節點數>6的模塊。模塊1(MCODE分數=6.438)包括33個節點，模塊2(MCODE分數=5.111)包括10個節點。KEGG通路分析結果如圖7A和B所示，結果表明模塊中的DEG在“IL-17信號通路”，“ECM-受體相互作用”，“破骨細胞分化”，“NF-κB信號通路”中顯著富集。IL-17信號通路在兩個模塊中均顯著富集，提示其可能在OA發展過程中起關鍵作用。

圖7 DEG的子模塊的通路富集分析。

3 討論

隨著醫療技術的飛速發展，已將許多方法用于治療KOA，包括物理療法、非甾體類抗炎藥、關節鏡和關節置換術等。不幸的是，目前沒有辦法有效地逆轉或阻止KOA的進展[21]。全膝關節置換術(TKA)被認為是治療終末期KOA的最后選擇，但TKA也存在諸如感染、翻修、功能不滿意等并發癥[22-23]。因此，研究骨關節炎的發病機理并尋找治療KOA的有效方法一直是研究的重點。過去一般認為滑膜炎性反應被認為是由軟骨磨損導致的碎片引起的[24]。但是，最近的研究[25]顯示，滑膜炎性反應可以被認為是骨關節炎的先兆，在放射學檢查發現軟骨損傷之前就已經存在。此外，有學者認為滑膜和脂肪膜下墊可被視為解剖功能單元，在KOA發生過程中加速軟骨損傷并引起疼痛[26]。因此，探索滑膜炎性反應的發病機制可能為KOA的治療提供新的視角。

本文納入了兩個GEO數據集，并使用生物信息學方法分析了279個DEG，包括133個上調基因和146個下調基因，并進行了GO和KEGG通路富集分析，以探索DEG在KOA進展過程中的生物學機制。KEGG通路富集分析結果顯示DEG主要在“類風濕關節炎”，“TNF信號途徑”，“PI3K-Akt信號途徑”和“破骨細胞分化”等通路富集，這與先前發表的文章相似[27-29]。GO富集結果顯示DEG主要富集在了“免疫反應”，“細胞黏附”和“炎性反應”等生物學過程。先前的研究表明，先天和后天免疫系統在OA過程中起關鍵作用[30]，并表明骨關節炎是一種炎性反應性疾病[31]。有趣的是，GO-CC分析結果顯示DEG主要富集在“細胞外囊泡”，“細胞外區域”和“細胞外空間”。外泌體是30-150 nm大小的細胞外囊泡，帶有脂質雙層膜，其中包含許多生物活性物質，如非編碼RNA、蛋白質和mRNA，在細胞間通訊中起重要作用[32-34]。這些DEG可以通過滑膜分泌到外泌體中，并被關節周圍的組織(如軟骨和脂肪墊)吸收，然后放大炎性反應并加重軟骨損傷，這進一步解釋了滑膜炎性反應在OA中的關鍵作用。

此外，本文構建了DEG的PPI網絡，并使用Cytoscape軟件進行可視化并根據自由度鑒定hub基因，結果顯示 IL-6，JUN和VEGFA具有最高的自由度。IL-6是一種炎性細胞因子，參與各種生物過程，包括炎性反應、免疫反應以及癌癥[35]。IL-6啟動子區的多態性引起歐洲人對類風濕性關節炎的易感性[36]，并與老年人骨關節炎的嚴重程度和功能狀態有關[37]。托珠單抗是一種IL-6抑制劑，可減輕OA引起的中樞敏化和慢性疼痛，并保留關節軟骨并增加骨量[38-39]。JUN是另一個hub基因，AP-1是JUN的激活蛋白，可以通過多種刺激調節，包括炎性細胞因子，氧化應激等[40]。許多MMPs啟動子包含潛在的AP-1結合位點，并且被細胞因子激活的AP-1也可以調節MMP表達。Tang等[41]提出c-JUN/AP-1信號通路調節人滑膜成纖維細胞中IL-6的表達。VEGFA是VEGF家族的創始成員，通常被稱為VEGF[42]。VEGF在骨骼發育和骨重構中起著調節血管生成的關鍵作用，并被懷疑在OA的發病機理中起著關鍵作用[43]。膝關節內注射VEGF可誘導OA樣變化，如關節軟骨降解、蛋白聚糖丟失、滑膜炎性反應以及軟骨下硬化[44]。臨床證據表明VEGF水平升高與OA進展有關[42,45]。最近的臨床前研究也顯示抑制VEGF可有效預防OA的關節破壞并減輕相關疼痛[42]。

最后，PPI網絡的子模塊分析表明，OA的發展與“IL-17信號通路”，“ECM-受體相互作用”，“破骨細胞分化”，“NF-κB信號通路”等相關。IL-17信號通路在這兩個模塊中都顯著富集，提示其可能在OA過程中起關鍵作用。IL-17主要由Th17細胞產生，Th17細胞是CD4+T細胞的一個亞群，主要參與誘導自身免疫和炎性疾病[46]。Liu等[47]發現與對照組相比，IL-17在OA中的表達明顯更高患者，并阻斷IL-17信號通路可延遲與OA相關的疼痛。同時，IL-17信號通路可以激活NF-kB和MAPK通路，而這些通路與OA的發展密切相關[48]。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一種促進軟骨分解，降解細胞外基質(ECM)成分并在OA中起重要病理作用的酶家族[49]。許多文章使用MMPs的表達水平來反映OA中軟骨損傷的程度，尤其是MMP-1、-3和-9[50-52]。PTGS2是與炎性反應相關的基因，在骨關節炎中高度相關[53]。NFKBIA、FOSB和JUND都與NF-kB和MAPK信號通路密切相關，它們在OA的病理過程中起著至關重要的作用[54-55]。

綜上所述，本研究在OA滑膜炎性反應過程中鑒定出279個DEG，這些DEG顯著富集在“風濕性關節炎”，“TNF信號傳導途徑”，“PI3K-Akt信號傳導途徑”和“破骨細胞分化”等通路。GO-CC的結果提示滑膜將DEGs釋放至外泌體，在KOA的信號傳遞中起關鍵作用，并加劇KOA進展。IL-17信號通路可能是治療KOA的重要靶標。