不同基原淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)相關(guān)藥效學(xué)比較研究

★ 胡浩武 高羽,2 周青罡 解立科 陳明蒼（.江西匯仁藥業(yè)股份有限公司 南昌 0052；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 009；.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所 上海 2020）

淫羊藿為常用的補(bǔ)腎壯陽(yáng)藥物，具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕、止咳平喘等作用，常用于腎陽(yáng)虛弱、陽(yáng)痿尿頻、筋骨痿軟、腰膝無(wú)力、風(fēng)濕痹痛、肢體麻木等癥的治療［1］。2020年版《中國(guó)藥典》收載了4種基原植物，即心葉淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.和朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai。研究發(fā)現(xiàn)，不同基原的淫羊藿中主要有效成分淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ等含量存在較大差異［2-3］，有效成分含量的差異可能會(huì)引起藥效學(xué)差異，然而不同基原淫羊藿的藥效作用有無(wú)明顯優(yōu)劣未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)的傳統(tǒng)功效，選擇氫化可的松制備腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型，比較不同基原淫羊藿在補(bǔ)腎壯陽(yáng)方面的藥效學(xué)差異，為其臨床藥材的選用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Chemray 240全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技公司）；ADVIA Centaur XP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（西門子有限公司）；i200全自動(dòng)免疫分析儀（美國(guó)雅培有限公司）；EPOCH全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；小動(dòng)物PET/CT活體成像系統(tǒng)（PerkinElmer）；COBAS C501全自動(dòng)生化分析儀（羅氏公司）。

1.2 藥材與樣品制備

心葉淫羊藿，采自甘肅隴南；朝鮮淫羊藿，采自吉林集安；箭葉淫羊藿，采自四川達(dá)州市大竹縣。經(jīng)江西匯仁藥業(yè)股份有限公司張聰中藥師鑒定均為正品。不同基原淫羊藿醇提物樣品均由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 材料

丙二醛MDA測(cè)試盒（批號(hào)：20190118）、總超氧化物歧化酶SOD測(cè)試盒（批號(hào)：20190327）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；三碘甲狀原氨酸（T3）試劑盒（批號(hào)：01569208）、甲狀腺素（T4）試劑盒（批號(hào)：27832196）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）試劑盒（批號(hào)：18932234）、游離甲狀腺素（T4）試劑盒（批號(hào)：01486107）均購(gòu)自西門子公司；睪酮試劑盒（批號(hào)：10766UP00）購(gòu)自雅培公司；肌酐試劑盒（批號(hào)：181212018）購(gòu)自德國(guó)羅氏診斷有限公司；環(huán)磷酸腺苷（cAMP）試劑盒（批號(hào)：L190401109）和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）試劑盒（批號(hào)：L190312247）均購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司；氫化可的松注射液（批號(hào)：1801170231/1801180231）購(gòu)自上海現(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180~220 g，150只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證編號(hào)為SCXK（滬）2017-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，溫度22~26 ℃，相對(duì)濕度40%~70%，人工光照，12 h明暗周期，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物自由飲水采食。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

SD大鼠按體重隨機(jī)分為11組，每組9只，分為正常組，模型組，心葉淫羊藿高、中、低劑量組（生藥量 10，5，1 g/kg），朝鮮淫羊藿高、中、低劑量組（生藥量10，5，1 g/kg），箭葉淫羊藿高、中、低劑量組（生藥量10，5，1 g/kg）。除正常組皮下注射等容量生理鹽水外，其余各組大鼠按25 mg/kg劑量皮下注射氫化可的松，連續(xù)20 d，復(fù)制腎陽(yáng)虛證模型。并于造模同時(shí)進(jìn)行給藥干預(yù)。所有藥物均采用0.5%CMC-Na溶液研磨配置。淫羊藿各劑量組灌胃給藥，正常組、模型組灌胃同體積飲用水，連續(xù)給藥20 d。

2.2 骨密度、破骨細(xì)胞數(shù)量和成骨細(xì)胞比例測(cè)定

采用小動(dòng)物PET-CT進(jìn)行離體股骨骨密度測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算骨密度。股骨經(jīng)多聚甲醛固定，脫鈣后切片，TRAP染色，并統(tǒng)計(jì)破骨細(xì)胞數(shù)量（個(gè)/200倍視野）。股骨經(jīng)脫鈣后切片，進(jìn)行成骨細(xì)胞標(biāo)志物骨鈣素OCN免疫組化染色，并統(tǒng)計(jì)掃描片上成骨細(xì)胞比例。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)200倍視野進(jìn)行截圖。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽(yáng)性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出，每張照片陽(yáng)性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA），并求出平均光密度值（AO），AO（%）=IOD/AREA×100。

2.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定

末次給藥后腹主動(dòng)脈取血測(cè)定血清中MDA、T3、T4、FT3、FT4、睪酮、肌酐、cAMP和cGMP。

2.4 腎臟HE病理

腎臟經(jīng)過多聚甲醛固定后，切片，HE染色，之后計(jì)算機(jī)掃描獲得病理照片。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠體重和攝食量的影響

與正常組比較，腎陽(yáng)虛模型大鼠的體重和每日攝食量出現(xiàn)顯著下降；與模型組比較，各給藥組大鼠體重和攝食量無(wú)明顯變化。

3.2 對(duì)血清甲狀腺功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠的甲狀腺功能指標(biāo)（T3、T4、FT3、FT4）均顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比較，心葉淫羊藿各劑量組均能不同程度提高T3、T4、FT3和FT4水平，中、低劑量組對(duì)大部分指標(biāo)表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；朝鮮淫羊藿中、低劑量組與模型組比各指標(biāo)均有顯著性差異；箭葉淫羊藿低劑量組大鼠的T4和FT4明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高、中劑量組對(duì)各指標(biāo)均無(wú)顯著差異。見表1。

表1 對(duì)血清甲狀腺功能指標(biāo)的影響（，n=9）

表1 對(duì)血清甲狀腺功能指標(biāo)的影響（，n=9）

注：與正常組比較，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 T3/（nmol·L-1） T4/（nmol·L-1） FT3/（pmol·L-1） FT4/（pmol·L-1）正常組 0.8±0.1 52.9±7.3 6.9±0.7 35.7±3.7模型組 0.6±0.1ΔΔ 27.8±5.9ΔΔ 5.0±1.6ΔΔ 27.9±4.7ΔΔ心葉淫羊藿低劑量組 0.7±0.1* 33.0±4.7* 5.9±0.6 32.8±2.2**心葉淫羊藿中劑量組 0.7±0.1 35.2±7.7* 6.0±0.8 32.5±3.8*心葉淫羊藿高劑量組 0.7±0.2 32.6±9.8 6.4±0.7* 31.2±4.5朝鮮淫羊藿低劑量組 0.8±0.2* 39.1±11.3* 6.3±0.5* 34.0±3.7**朝鮮淫羊藿中劑量組 0.8±0.2* 34.3±6.2* 6.3±0.4* 32.1±3.5*朝鮮淫羊藿高劑量組 0.7±0.1 34.5±11.3 4.2±0.5 31.6±3.8箭葉淫羊藿低劑量組 0.7±0.1 36.2±7.9* 4.2±0.4 34.6±3.3**箭葉淫羊藿中劑量組 0.7±0.1 27.0±7.0 4.0±0.3 29.6±4.3箭葉淫羊藿高劑量組 0.7±0.1 26.5±6.0 4.0±0.3 27.1±4.1

3.3 對(duì)血清腎功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠的肌酐水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，心葉淫羊藿和朝鮮淫羊藿的中、低劑量組可顯著降低血肌酐含量，而箭葉淫羊藿各劑量組無(wú)明顯作用。見表2。

表2 對(duì)血清中肌酐、MDA、睪酮的影響（，n=9）

表2 對(duì)血清中肌酐、MDA、睪酮的影響（，n=9）

注：與正常組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

睪酮/（nmol·L-1）正常組 21.1±3.8 5.9±0.7 19.1±3.8模型組 25.7±4.8Δ 7.1±0.6ΔΔ 9.8±3.6ΔΔ心葉淫羊藿低劑量組 21.2±2.8* 6.6±0.6 15.7±3.0**心葉淫羊藿中劑量組 21.0±4.0* 5.9±0.9** 15.8±4.5**心葉淫羊藿高劑量組 23.7±3.6 6.1±0.9* 11.8±3.4朝鮮淫羊藿低劑量組 20.1±3.3* 7.4±1.5 16.3±3.8**朝鮮淫羊藿中劑量組 21.4±3.2* 7.1±1.4 19.8±3.8**朝鮮淫羊藿高劑量組 24.4±4.2 6.9±0.6 13.7±4.3*箭葉淫羊藿低劑量組 25.3±2.3 5.6±0.9** 9.7±3.8箭葉淫羊藿中劑量組 23.2±4.6 5.9±1.0** 9.8±4.5箭葉淫羊藿高劑量組 23.4±6.0 6.5±1.1 8.5±2.8組別 肌酐/（μmol·L-1）MDA/（pmol·L-1）

3.4 對(duì)血清氧化指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠的MDA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比，心葉淫羊藿的高、中劑量組以及箭葉淫羊藿的中、低劑量組大鼠MDA明顯下降，差異具顯著性（P＜0.05，P＜0.01），而朝鮮淫羊藿各劑量組無(wú)顯著變化。見表2。

3.5 對(duì)血清睪酮的影響

與正常組比較，模型組大鼠的睪酮水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，心葉淫羊藿的低、中劑量組以及朝鮮淫羊藿各劑量組大鼠的睪酮水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），而箭葉淫羊藿無(wú)明顯作用。見表2。

3.6 對(duì)股骨骨密度和股骨破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的影響

與正常組比較，模型組大鼠的骨密度和成骨細(xì)胞比例明顯降低，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異具顯著性（P＜0.05）；與模型組相比，心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿各劑量組均可不同程度地增加骨密度，部分劑量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異水平（P＜0.05，P＜0.01）；心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿各劑量組均可明顯降低破骨細(xì)胞數(shù)量；3種淫羊藿對(duì)成骨細(xì)胞比例雖有增加趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異水平。見表3。

表3 對(duì)大鼠股骨骨密度的影響（，n=9）

表3 對(duì)大鼠股骨骨密度的影響（，n=9）

注：破骨細(xì)胞數(shù)量指200倍視野下；與正常組比較，ΔP＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

成骨細(xì)胞比例/%正常組 1343.5±24.5 36.8±13.8 0.28±0.13模型組 1315.5±22.9Δ 50.6±10.5Δ 0.15±0.05Δ心葉淫羊藿低劑量組 1334.2±26.1* 43.1±9.0 0.19±0.05心葉淫羊藿中劑量組 1339.8±25.1* 40.3±6.6* 0.18±0.07心葉淫羊藿高劑量組 1344.0±28.1* 39.0±7.2* 0.18±0.06朝鮮淫羊藿低劑量組 1344.7±28.8* 32.2±5.1** 0.18±0.07朝鮮淫羊藿中劑量組 1338.3±18.0* 35.1±6.1** 0.19±0.09朝鮮淫羊藿高劑量組 1338.2±224.4 38.9±5.4* 0.17±0.07箭葉淫羊藿低劑量組 1327.6±12.1* 35.2±5.5** 0.19±0.10箭葉淫羊藿中劑量組 1337.1±16.6* 37.6±8.1* 0.16±0.05箭葉淫羊藿高劑量組 1331.4±8.6 37.9±7.8** 0.17±0.08組別 骨密度/（mg·cc-1）破骨細(xì)胞數(shù)量/個(gè)

3.7 對(duì)血清cAMP、cGMP及比值的影響

與正常組比較，模型組大鼠的cAMP和cAMP/cGMP明顯降低，cGMP明顯增加，差異具顯著性（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿各劑量組均可明顯增加cAMP，除箭葉淫羊藿中劑量組外各給藥組的差異具顯著性（P＜0.01）；cGMP指標(biāo)上，各給藥組與模型組比無(wú)明顯變化；各給藥組的cAMP/cGMP比值均有不同程度增加，其中朝鮮淫羊藿中、高劑量組達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見表4。

表4 對(duì)血清cAMP、cGMP及比值的影響（，n=9）

表4 對(duì)血清cAMP、cGMP及比值的影響（，n=9）

注：與正常組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

cAMP/cGMP正常組 98±20 475±139 229±99模型組 55±23ΔΔ 923±518Δ 77±57ΔΔ心葉淫羊藿低劑量組 87±12** 938±370 108±48心葉淫羊藿中劑量組 98±16** 947±401 117±46心葉淫羊藿高劑量組 104±22** 1 208±423 91±18朝鮮淫羊藿低劑量組 167±71** 1 146±239 146±60朝鮮淫羊藿中劑量組 185±54** 1 049±266 208±99*朝鮮淫羊藿高劑量組 181±61** 1 136±384 177±74*箭葉淫羊藿低劑量組 110±31** 1 164±621 120±63箭葉淫羊藿中劑量組 92±57 1 302±705 95±82箭葉淫羊藿高劑量組 116±48** 1 025±720 136±99組別 cAMP/（ng·mL-1）cGMP/（pg·mL-1）

3.8 對(duì)腎臟病理的影響

腎臟病理檢查表明，腎陽(yáng)虛模型組可見腎小球球囊間隙明顯增寬，提示腎小囊內(nèi)壓增大。與模型組相比，心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿以及箭葉淫羊藿個(gè)別劑量組能明顯改善腎小球球囊間隙增寬，代表性圖像見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織的典型病理形態(tài)圖（HE染色）

4 討論

腎陽(yáng)虛證模型制備目前應(yīng)用最廣泛的是采用氫化可的松誘導(dǎo)大鼠或小鼠腎陽(yáng)虛模型［4-5］，該模型存在著下丘腦-垂體-靶腺軸（腎上腺軸、甲狀腺軸、性腺軸）不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂，類似于臨床腎陽(yáng)虛證的基本病理特征［6］，通常表現(xiàn)為促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）下降，cAMP、cGMP含量及比值改變，睪丸分泌T水平下降，產(chǎn)生大量氧自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，骨密度和骨代謝指標(biāo)變化等［5,7-8］。本研究采用大鼠皮下注射氫化可的松模型模擬腎陽(yáng)虛證［9］，造模前大鼠發(fā)育正常、飲食正常、被毛理順光澤，造模后大鼠的體重顯著下降、甲狀腺功能指標(biāo)下降、肌酐和MDA水平顯著升高、睪酮水平顯著降低、骨密度和成骨細(xì)胞比例明顯降低、破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加、cAMP明顯降低、cGMP明顯增加、腎小球球囊間隙明顯增寬，符合臨床腎陽(yáng)虛證的基本病理特征，表明模型建立成功。

本研究結(jié)果顯示，不同基原淫羊藿對(duì)腎陽(yáng)虛不同藥效指標(biāo)的影響有相似性，但在藥效強(qiáng)度上也存在著一定差異性：（1）對(duì)血清甲狀腺功能指標(biāo)的改善作用：心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿均能不同程度地提高甲狀腺激素T3、T4、FT3和FT4的水平，而箭葉淫羊藿對(duì)T4和FT4有明顯改善作用，總體上朝鮮淫羊藿作用最強(qiáng)，心葉淫羊藿次之，箭葉淫羊藿較弱；（2）對(duì)腎功能指標(biāo)的改善作用：心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿均可顯著降低血肌酐水平，兩者藥效相當(dāng)，而箭葉淫羊藿作用不明顯；心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿均能明顯改善腎小球球囊間隙增寬；（3）抗氧化作用：心葉淫羊藿和箭葉淫羊藿均可顯著降低MDA水平，兩者藥效相當(dāng)，而朝鮮淫羊藿作用不明顯；（4）對(duì)血清睪酮的影響：心葉淫羊藿和朝鮮淫羊藿可顯著增加睪酮水平，而箭葉淫羊藿作用不明顯；（5）對(duì)骨密度和破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的影響：心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿均可顯著增加骨密度，降低破骨細(xì)胞數(shù)量，三者藥效作用強(qiáng)度相當(dāng)；（6）對(duì)血清cAMP、cGMP及比值的影響：心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿均可顯著提高cAMP，朝鮮淫羊藿可顯著提高cAMP/cGMP比值，總體上朝鮮淫羊藿的作用稍強(qiáng)。文獻(xiàn)顯示這3種基原淫羊藿化學(xué)成分總黃酮含量差別不大，而在特征性有效成分淫羊藿苷、朝藿定C和寶藿苷Ⅰ含量上，箭葉淫羊藿與心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿的差異較大，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示箭葉淫羊藿在個(gè)別藥效指標(biāo)上作用強(qiáng)度的差異性可能和主要特征性有效成分含量差異性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各給藥組對(duì)腎陽(yáng)虛不同藥效學(xué)指標(biāo)的影響沒有劑量依賴性，就甲狀腺功能指標(biāo)上來(lái)說(shuō)，朝鮮淫羊藿低劑量組與模型組比較，已具有顯著性差異，但是高劑量組沒有顯著性差異或者高劑量組的指標(biāo)水平?jīng)]有升高反而降低，可能原因在于中藥成分和作用機(jī)理復(fù)雜，其藥效是多組分的聯(lián)合作用，而且往往具有雙向調(diào)節(jié)作用，劑量過大可能會(huì)引起了負(fù)反饋?zhàn)饔茫?0］。而體內(nèi)甲狀腺激素本身存在著一個(gè)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，當(dāng)甲狀腺激素分泌過多時(shí)，會(huì)抑制促甲狀腺激素（TSH）的釋放，反過來(lái)會(huì)減少甲狀腺激素的分泌，從而達(dá)到甲狀腺激素的調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)［11］，這種效應(yīng)會(huì)抵消藥物的作用，使藥物的療效下降或喪失。

綜上所述，本研究結(jié)果提示心葉淫羊藿、朝鮮淫羊藿和箭葉淫羊藿3種基原淫羊藿在治療腎陽(yáng)虛證方面可以相互替代，但藥效作用強(qiáng)度的側(cè)重點(diǎn)有所差異，臨床應(yīng)用上在必要時(shí)可根據(jù)腎陽(yáng)虛證癥狀表現(xiàn)上的差異或用藥需求區(qū)別使用。