48例晚期肺腺癌患者繼發耐藥后外周血T790M突變對預后的影響*

胡愛民，鄭 華，李 琨，高 遠，劉 贊，張同梅，李寶蘭△

(首都醫科大學附屬北京胸科醫院/北京市結核病胸部腫瘤研究所：1.腫瘤內科 ；2.病理科 101149)

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)的上市是肺癌治療領域的里程碑，其使EGFR敏感突變的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者無進展生存期(progression free survival，PFS)延長，生活質量得到改善。但EGFR-TKI耐藥不可避免，多出現在用藥后1年左右[1]，在EGFR-TKI繼發性耐藥患者中，約50%為T790M突變[2]，多項研究均表明，晚期肺癌患者外周血EGFR基因突變狀態檢測，可作為腫瘤組織基因檢測的重要補充[3-6]，外周血基因檢測結果一定程度上可反映患者整體的基因突變狀態。因此，為研究對一代EGFR-TKI耐藥的晚期肺腺癌外周血EGFR對預后的影響，本研究收集晚期肺腺癌患者耐藥后的外周血，使用超級擴增阻滯突變系統(super-amplification refractory mutation system,super-ARMS)法檢測T790M基因突變，并分析其與臨床特征、療效和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過首都醫科大學附屬北京胸科醫院住院病案檢索系統及門診系統，對2014年5月1日至2016年12月31日的住院患者進行檢索，共收集110例接受一代EGFR-TKI治療的晚期肺腺癌患者，篩選出對一代EGFR-TKI耐藥的患者48例。進行回顧性研究。納入標準：(1)組織學確診為Ⅲb/Ⅳ肺腺癌患者；(2)患者在治療前已行組織EGFR基因檢測，明確有EGFR基因敏感突變，且接受EGFR-TKI靶向治療；(3)48例患者均在靶向治療開始后每隔6～8周進行CT檢查，直至病情進展后收集血液標本，并行進展后組織活檢。

1.2 方法

1.2.1收集資料

資料內容記錄包括患者的性別、年齡、吸煙、確診日期和進展日期，美國東部腫瘤協作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體力功能狀態評分，TNM分期(2015年第7版分期標準)，最初EGFR突變，一代TKI藥物名稱，耐藥后進展類型(局部進展或遠處轉移)，進展后血液T790M突變狀態，組織T790M突變狀態。符合上述入組標準的患者共48例，年齡37～78歲，中位年齡62歲。其中，男22例，女26例。不吸煙患者(不吸煙規定為一生吸煙少于100支)所占比例64.6%(31/48)。ECOG評分為0～1分47例，2～3分1例。ⅢB期8例，Ⅳ期40例。所有患者在治療前均經組織活檢明確有EGFR基因敏感突變，其中19-Del突變31例，21-L858R突變17例，均無原發性T790M突變。EGFR-TKI作為二線及以上治療占43.8%(21/48)。初始EGFR-TKI治療中位PFS為11.7個月。

1.2.2樣本采集、分離及實驗方法

所有患者在胸部CT檢查提示病情進展后，采集清晨空腹靜脈血5 mL，置于帶有血清分離凝膠的離心管內，于抽血后2 h內分離血漿，首先2 000×g 離心10 min，取上層血清；再8 000×g 離心10 min，取上清液，按Qiagen (55114)QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit試劑盒說明書，提取外周血游離DNA，立即進行檢測，否則放置于-20 ℃保存。將待測樣本DNA質量濃度稀釋到1～3 ng/μL，利用多重熒光PCR法(人類EGFR突變基因檢測試劑盒，廈門艾德)，檢測所有樣本的EGFR驅動基因突變。用SLAN96S實時熒光PCR儀(上海宏石)進行檢測。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min,1個循環；95 ℃變性40 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，15個循環；93 ℃變性40 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，28個循環。

1.2.3結果判斷標準

1.2.3.1EGFR基因突變狀態判斷

按說明書提供的判讀原則，用ΔCt值(Ct突變-Ct外控)確定標本EGFR基因突變：當Ct突變小于28、T790M ΔCt突變小于或等于7，判斷為突變陽性。反之則為陰性或低于本試劑盒的檢測下限。

1.2.3.2療效評價

靶向治療開始后，每2個月進行CT影像學檢查。近期療效參照實體瘤療效評價標準RECIST 1.1制定，分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response,PR)、穩定(stable disease,SD)和進展(progressive disease,PD)，CR+PR為有效。PFS定義為從EGFR-TKI治療的第1天開始到疾病進展、死亡和最后1次隨訪。OS定義為從疾病確診的第1天開始至死亡或最后1次隨訪的時間。

1.2.4隨訪

采用首都醫科大學附屬北京胸科醫院病案管理系統及門診系統，通過電話和復診等方式進行隨訪，48例患者無失訪。隨訪至2020年2月1日。

1.3 統計學處理

采用SPSS16.0 軟件對數據進行統計分析。計數資料以率表示，組間比較采用χ2或Fisher’s檢驗；采用壽命表和Kaplan-Meier 方法計算生存率、中位生存期，繪制生存曲線，Log-rank 檢驗生存率差異，采用Cox 比例風險回歸模型進行多因素分析。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 48例一代EGFR-TKI耐藥的晚期肺腺癌患者PFS影響因素分析

48例晚期肺腺癌繼發耐藥患者中，骨轉移33例(68.8%，33/48)，顱內轉移18例(37.5%，18/48)，肝轉移9例(18.8%，9/48)，單純胸腔內轉移6例(12.5%，6/48)。中位PFS為11.7個月，中位OS為30.4個月。單因素分析顯示一代EGFR-TKI治療的PFS與外周血T790M突變及一代EGFR-TKI治療藥物有關(P=0.021、0.040)；血T790M突變陽性患者比T790M突變陰性患者PFS更長(12.4個月vs.9.4個月)，且一代TKI藥物作為二線治療的比一線治療的患者中位PFS更長(14.6個月vs.10.4個月)，見表1。多因素分析顯示，PFS僅與外周血T790M突變與有關，而OS與患者年齡、性別、吸煙狀況、外周血T790M突變、一代EGFR-TKI藥物治療線數及耐藥后進展類型均無關，見表2。

表1 48例一代EGFR-TKI耐藥的晚期肺腺癌患者PFS影響因素分析

表2 48例一代EGFR-TKI耐藥晚期肺腺癌患者PFS及OS的多變量COX模型分析

2.2 48例一代EGFR-TKI耐藥的晚期肺腺癌患者血T790M基因突變的影響因素分析

48例晚期肺腺癌患者中，血檢T790M陽性突變26例(54.2%)，血T790M基因突變的影響因素與耐藥后進展類型有關，有遠處轉移者更容易出現血T790M突變陽性(χ2=10.018，P=0.002)，見表3。

表3 48例一代EGFR-TKI耐藥晚期肺腺癌患者血T790M突變的影響因素分析[n(%)]

續表3 48例一代EGFR-TKI耐藥晚期肺腺癌患者血T790M突變的影響因素分析[n(%)]

3 討 論

一代EGFR-TKI治療出現影像學進展后，組織活檢仍是T790M突變檢測的金標準[7-9]，但組織標本獲取較困難、標本有限、質量不可控制，而液體活檢標本易得、重復獲取容易、能克服腫瘤異質性，是有力的補充。本研究對有EGFR敏感突變的晚期肺腺癌患者，在一代EGFR-TKI治療進展后，采用super-ARMS檢測血T790M基因，結果顯示，在48例繼發耐藥患者中，血T790M突變陽性率54.2%(26/48)。多項研究表明，在一代EGFR-TKI耐藥的患者中，外周血標本中EGFR基因T790M基因突變陽性率低于組織標本，外周血T790M突變陽性率為16.6%～32.4%[3-6]。GAO等[10]在105例中國患者中，ARMS檢測出的T790M陽性率為54%。本組采用第二代ARMS檢測技術super-ARMS，在引物基礎上添加了成環結構，提高了拷貝模板的特異結合能力，具有高度的選擇性和敏感性。有研究發現，初始突變為19-Del的患者相較于L858R突變的患者更容易發生T790M突變[11]。本組患者血T790M突變陽性率偏高，可能因為樣本量較小，且19-Del患者較多(64.6%，31/48)，尚需更多的研究來探索其原因。本研究結果證實，通過super-ARMS檢測血T790M基因，是組織活檢的有力補充。

本組結果單因素分析顯示，一代EGFR-TKI耐藥后血T790M突變陽性患者比T790M突變陰性患者PFS更長(12.4個月vs.9.4個月)，且一代TKI藥物作為二線治療的比一線治療的患者PFS更長(14.6個月vs.10.4個月)。而多因素分析顯示，PFS僅與血T790M突變狀態有關。OXNARD等[12]發現，一代TKI治療進展后有T790M突變陽性的進展后生存期明顯長于無T790M突變患者，還有研究發現，T790M突變陽性出現的概率在曾經或還在接受EGFR-TKI治療的患者中更高(61.9%，26/42)[13]，這可能與長期EGFR-TKI治療對T790M耐藥突變的誘導有關，而不是在NSCLC進展的自然過程中發生。本組48例患者中，有21例將一代TKI作為二線治療，主要為厄洛替尼(16/21)，其PFS更長。其可能原因：(1)臨床研究發現厄洛替尼相比吉非替尼及埃克替尼有更長的PFS；(2)經過一線化療后，腫瘤負荷減輕，治療效果相對會更好；(3)經過多線治療后EGFR耐藥基因可被激活從而誘導耐藥突變的發生。目前晚期肺癌EGFR突變陽性患者的治療模式有靶向聯合化療、序貫化療等，但關于不同模式治療療效的研究相對較少。靳海濤[14]對入組64例晚期NSCLC患者進行研究，結果發現，與先靶向后化療治療方法相比，采用先化療后靶向治療近期臨床療效明顯，但兩種治療方法對患者PFS及OS無統計學差異。本組多因素分析顯示，一代TKI的治療線數并不影響PFS和OS，尚需大樣本的前瞻性研究來證實。

本研究結果還顯示，血T790M基因突變的影響因素與耐藥后進展類型有關，有遠處轉移者更容易出現血T790M突變陽性。這可能是因為遠處轉移患者的腫瘤突變負荷更高，在血液中更容易檢測到。本組中骨轉移33例(68.8%，33/48)，顱內轉移18例(37.5%，18/48)，肝轉移9例(18.8%，9/48)，單純胸腔內轉移6例(12.5%，6/48)。有研究發現，T790M突變與耐藥后轉移部位有關，161例患者中共有74例T790M突變，其中，有骨轉移的患者T790M的突變率為61.9%，而有腦轉移的患者T790M的突變率為38.5%，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)[15]。ZHANG等[16]將患者分為胸腔內轉移、顱內轉移和其他(其他遠處轉移及多發轉移)3組，結果發現第3組患者更易發生T790M突變。該結論對于一代EGFR-TKI療效的臨床評估具有指導意義。

目前三代EGFR-TKI靶向藥奧西替尼已廣泛應用于對一代靶向耐藥后出現T790M突變的晚期NSCLC患者。它通過與EGFR激酶區ATP結合域的半胱氨酸-797殘基不可逆共價結合，抑制其下游信號通路，從而抑制腫瘤增殖；體外實驗也證明，奧西替尼與T790M突變的EGFR親和力是野生型的200倍[17]。全球Ⅲ期臨床研究AURA3試驗表明，與標準化療相比，奧西替尼的中位PFS明顯增加(4.4個月vs.10.1個月)，客觀緩解率也明顯提高(31%vs.71%)，中位緩解持續時間明顯增加(4.1個月vs.9.7個月)。

綜上所述，檢測T790M突變具有重大的臨床價值，尤其是液體活檢可以作為組織學檢測的補充手段，有利于及早發現耐藥，指導患者的個體化治療。由于本文為回顧性研究，還需要更多的樣本量和前瞻性研究來證明此結論。