miRNA-146a通過JAK/STAT3信號通路對燒沖復合傷大鼠心臟功能的影響*

姜萬嵩，韓庚奮，劉 成，張成生，張景陽，馬 驍△，姚興偉

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六九醫院:1.衛勤處；2.骨科，呼和浩特 010051)

燒沖復合傷是熱力、沖擊波相繼或同時作用于機體造成的復合傷，可能發生在煤氣泄漏、礦難、交通意外、化工廠等意外爆炸中，致殘率及病死率較高[1-2]。有研究顯示，燒沖復合傷的超壓可引起心臟受損，導致心肌組織發生炎性反應、變性甚至壞死[3]。謝鋒等[4]研究發現，燒沖復合傷大鼠的心肌細胞凋亡增加，心臟功能受到嚴重損害，如果人體受到燒沖復合傷會造成其心臟受損，嚴重影響患者的生活質量及生命安全。因此，探究其發生的可能機制對于保護心臟具有重要意義。微RNA(miRNA)是一類進化高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，在免疫反應、炎性反應等環節中發揮重要作用，miRNA-146a位于第5號染色體上，是參與炎性應答的重要miRNA之一[5]。有研究顯示，心臟收縮功能障礙小鼠心肌組織中miRNA-146a呈現低表達，上調miRNA-146a后可明顯改善心臟功能[6]。李靜等[7]研究認為，miRNA-146a降低與心肌組織受損密切相關，提高miRNA-146a表達后可明顯減輕心肌炎性反應，對心臟損傷具有一定的保護作用。Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子3(JAK/STAT3)信號通路在炎性反應、免疫調節等方面發揮重要作用，與心臟功能損傷聯系密切。LI等[8]研究顯示，激活心肌組織中JAK/STAT3通路可降低急性心肌梗死小鼠心肌炎性反應，對心臟具有一定的保護作用，但關于miRNA-146a、JAK/STAT3通路與燒沖復合傷大鼠心臟受損之間的研究較少。因此，本研究通過建立燒沖復合傷大鼠模型，探究miRNA-146a通過JAK/STAT3信號通路對燒沖復合傷大鼠心臟功能的影響，為臨床治療燒沖復合傷心臟功能損傷保護提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物

48只SPF級SD雄性大鼠(浙江維通利華實驗動物技術有限公司)，生產許可證號為SCXK(浙)2019-0001，體重約為210 g。大鼠均在本院動物房飼養，12 h晝夜交替，自由飲食、飲水，動物房溫度25 ℃左右，相對濕度50%左右，保持動物房干凈、通風，定時清潔鼠籠。本研究經動物倫理委員會批準同意。實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷。

1.1.2主要試劑及儀器

爆炸致傷裝置由中國兵器工業研究院提供；JAK/STAT3通路抑制劑AG490(133550-30-8)購自美國MCE公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒、蛋白質提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：G1121、G1340、BC3711、PC0020、SEKR-0002、SEKR-0009、SEKR-0005)購自北京索萊寶科技有限公司；肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、ELISA試劑盒(貨號：ab285275、ab246529)購自英國Abcam公司；miRNA-146a agomir、miRNA-146a agomir陰性對照、miRNA-146a和U6引物購自上海吉瑪制藥技術有限公司；p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、β-actin兔源抗體、羊抗兔IgG二抗(貨號：ab32101、ab108596、ab76315、ab68153、ab9485、ab6127)購自英國Abcam公司；多功能酶標儀(EnSight)購自美國PerkinElmer公司；光學顯微鏡(ContourGT-X3)購自美國Bruker公司；組織勻漿機(Tissuelyser-192)購自上海靜信實業發展有限公司；RT-qPCR儀(Step One TM)購于美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備及分組給藥

48只SD大鼠按照隨機數字法分為對照組、模型組、miRNA-146a陰性對照組(陰性對照組)、miRNA-146a過表達組(過表達組)、JAK/STAT3通路抑制劑AG490組(AG490組)、miRNA-146a過表達+AG490組(聯合組)，每組8只，除對照組，其余大鼠均構建燒沖復合傷大鼠模型。

燒沖復合傷大鼠模型的構建參考文獻[9]，并適當修改，造模大鼠麻醉后剔除背部25%的毛發并固定于鼠架上，放于距離爆炸源50 cm處的爆炸實驗現場，爆炸源為5 g黑索金炸藥，建立中度沖擊傷模型；接著將大鼠背部脫毛區域置于94 ℃熱水中12 s，形成約20%的燒傷，獲得燒沖復合傷大鼠模型，用聚維酮碘消毒大鼠燙傷創面防止感染，腹腔注射生理鹽水防休克，觀察到大鼠呼吸急促、進食量減少、精神萎靡等癥狀為模型構建成功。對照組大鼠僅進行背部脫毛并浸入37 ℃溫水中12 s。造模前6 h禁食不禁水，造模過程中出現不符合條件或死亡現象，及時用備用大鼠進行造模處理。

動物給藥參照說明書及文獻[10]，過表達組、陰性對照組分別經尾靜脈注射miRNA-146a agomir慢病毒、miRNA-146a agomir陰性對照各20 μg，術前每周注射2次，共注射2周；AG490組于術前24 h尾靜脈注射5 mg/kg AG490[11]，同時以與過表達組同樣的方法尾靜脈注射等量生理鹽水；聯合組于術前每周尾注射miRNA-146a agomir慢病毒20 μg 2次，共注射2周后，于術前24 h尾靜脈注射5 mg/kg AG490；對照組、模型組以同樣的方法尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2大鼠心功能相關指標測定

造模結束后24 h，對各組大鼠行超聲心動圖檢查，記錄大鼠左心室射血分數(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室收縮壓(LVSP)。用乙醇對大鼠腹部皮膚進行消毒處理，切開皮膚暴露主動脈后取血約4 mL，低溫靜置30 min后離心15 min(3 000 r/min)，取血清，采用CK-MB、cTnⅠ ELISA試劑盒測定其中CK-MB、cTnⅠ水平。

超聲心動圖檢查結束后進行血流動力學指標的測定，分離大鼠右頸總動脈并結扎遠心端，通過聚乙烯微管系統充入0.3%肝素進行抗凝處理，將導管插入頸動脈、升主動脈，待壓力值穩定10 min后采用多道生理儀記錄左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室收縮末壓(LVESP)、左心室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)、左心室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)。

1.2.3大鼠心肌組織HE及Masson染色觀察

取適量大鼠心肌組織，置于4%多聚甲醛中約24 h進行固定處理，用由低到高濃度梯度的乙醇進行脫水處理，用二甲苯溶液進行透明處理，用融化的石蠟進行包埋處理，蠟塊凝固后切片處理，將得到的石蠟切片放入二甲苯中脫蠟，用無水乙醇洗去二甲苯后經過不同濃度乙醇處理、蒸餾水沖洗，各選取3張切片分別進行蘇木素染色、水洗、返藍液返藍、水洗、伊紅染色及Masson染色，水洗、乙醇和二甲苯處理后進行風干、封片，得到病理組織切片，置于光學顯微鏡下觀察并分析。具體操作步驟參考HE及Masson染色試劑盒。

1.2.4大鼠心肌組織炎癥因子水平檢測

取適量大鼠心肌組織，用組織勻漿機制成心肌組織勻漿，低溫離心后取上清液，根據TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒中的操作要求測定各組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子表達水平。

1.2.5大鼠心肌組織miRNA-146a表達檢測

取適量大鼠心肌組織，采用RNA提取試劑盒提取心肌組織中的總RNA，采用反轉錄試劑盒得到cDNA，對miRNA-146a進行擴增，采用RT-qPCR儀測定心肌組織中miRNA-146a表達水平。miRNA-146a上游引物：5′-GGG TGA GAA CTG AAT TCC A-3′，下游引物：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；以U6為內參，上游引物：5′-GCT TCG GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游引物：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。反應體系有上下游引物各0.5 μL、cDNA 1 μL、SYBR Mix 10 μL，PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性5 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s，40個循環，根據2-ΔΔCT算法分析miRNA-146a mRNA表達。

1.2.6Western blot檢測大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達水平

取適量大鼠心肌組織，經預冷的生理鹽水沖洗干凈后在冰上將其剪成小顆粒，根據蛋白提取試劑盒的要求提取心肌組織中的總蛋白，采用BCA試劑盒測定其中蛋白濃度，將各組蛋白濃度調至相同，加熱變性后自然冷卻，取20 μL待測樣品液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實驗分離蛋白，將分離的蛋白經過濕轉法轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，根據分子量將目的蛋白條帶剪下置于孵育盒中，加入兔源p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3、GAPDH(1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱中孵育過夜，用TBST緩沖溶液漂洗后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h后用TBST緩沖溶液漂洗，經過顯影后用Image-J軟件分析相關蛋白的表達情況。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠超聲心動圖指標比較

與對照組比較，模型組大鼠LVEF、LVSP、LVFS值明顯降低(P<0.05)，血清CK-MB、cTnⅠ水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陰性對照組及AG490組，上述指標差異無統計學意義(P>0.05)；過表達組LVEF、LVSP、LVFS值明顯升高(P<0.05)，血清CK-MB、cTnⅠ水平明顯降低(P<0.05)。與過表達組比較，聯合組大鼠LVEF、LVSP、LVFS值明顯降低(P<0.05)，血清CK-MB、cTnⅠ水平明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠超聲心動圖指標比較

2.2 各組大鼠血流動力學指標比較

與對照組比較，模型組大鼠LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR值明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組及AG490組，上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，過表達組LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR值明顯升高(P<0.05)，LVEDP明顯降低(P<0.05)；與過表達組比較，聯合組大鼠LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR值明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血流動力學指標比較

2.3 各組大鼠心肌組織損傷比較

對照組大鼠心肌細胞排列整齊、分布均勻，心肌組織結構無明顯損害；模型組大鼠心肌細胞壞死較嚴重且排列紊亂，出現肌纖維束斷裂、炎性細胞浸潤、纖維化變性等現象；與模型組比較，陰性對照組及AG490組大鼠心肌組織損害情況類似，過表達組大鼠心肌組織損傷得到一定的恢復；與過表達組比較，聯合組大鼠心肌組織損傷較嚴重，見圖1、2。

A：對照組；B：模型組；C：陰性對照組；D：過表達組；E：AG490組；F：聯合組。

A：對照組；B：模型組；C：陰性對照組；D：過表達組；E：AG490組；F：聯合組。

2.4 各組大鼠心肌組織炎癥因子表達水平比較

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織炎癥因子表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組及AG490組差異無統計學意義(P>0.05)，過表達組心肌組織炎癥因子表達水平降低(P<0.05)；與過表達組比較，聯合組大鼠心肌組織炎癥因子表達水平明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠心肌組織炎癥因子表達水平比較

2.5 各組大鼠心肌組織miRNA-146a表達水平比較

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織miRNA-146a表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組及AG490組差異無統計學意義(P>0.05)，過表達組心肌組織miRNA-146a表達水平明顯升高(P<0.05)；與過表達組比較，聯合組大鼠心肌組織miRNA-146a表達差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與陰性對照組比較；d：P<0.05，與過表達組比較；e：P<0.05，與AG490組比較。

2.6 各組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達水平比較

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組和AG490組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，過表達組心肌組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達水平升高(P<0.05)。與過表達組比較，聯合組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，見表4、圖4。

表4 各組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達水平比較

A：對照組；B：模型組；C：陰性對照組；D：過表達組；E：AG490組；F：聯合組。

3 討 論

燒沖復合傷是現代工業、爆炸材料研究中常見的創傷，其造成的傷害由兩個或兩個以上傷害因素同時或相繼造成的復合損傷，從而對人體造成更嚴重的傷害[12-13]。與單純燒傷相比，燒沖復合傷發病機制更加復雜，從而增加了其治療難度[14]。有研究發現，燒沖復合傷會導致大鼠心臟功能明顯受損，對大鼠的生命體征及傷情造成負面影響[15]。其中，瞬間快速的血流動力學變化是造成心臟受損的主要原因。CHAI等[16]研究表明，目前常用爆炸聯合94 ℃熱水燒傷的方法構建燒沖復合傷動物模型，該方法構建的模型較穩定且較接近實際，具有爆炸參數清晰、爆炸載荷穩定、易控制等優點。本研究采用此方法構建燒沖復合傷大鼠模型后發現，燒沖復合傷大鼠的LVEF、LVSP、LVFS、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、心率水平明顯降低，血清CK-MB、cTnⅠ、LVEDP水平明顯升高，心肌組織受損嚴重，炎癥因子水平明顯升高，提示燒沖復合傷可引起大鼠心肌組織損害、引發心肌炎癥及纖維化變性，導致心功能嚴重受損，本研究結果表明，采用爆炸聯合94 ℃熱水燒傷的方法構建燒沖復合傷動物模型是一種均勻穩定的沖擊波，條件易于控制，重復性佳，且可以對大鼠整體受到沖擊，而非單一器官損傷，表明本研究模型構建成功。

miRNA是長度約為18～22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在心血管疾病、神經退行性疾病、癌癥等疾病的發生、發展中占有重要地位[17]。研究表明miRNA-146a與冠心病、缺血性腦卒中等動脈粥樣硬化疾病密切相關[18]。大量炎癥因子的釋放是導致心臟組織損傷的主要原因之一，TNF-α可導致心臟炎性反應級聯放大，可激活炎性細胞，進而對心肌細胞造成損傷，損害心臟功能，趙思嘉等[19]研究發現，miRNA-146a高表達可抑制自身免疫性心肌炎大鼠的心肌炎性反應。另外，miRNA-146a可能是通過與TNF-α受體相關蛋白及IL-1受體相關激酶結合，抑制TNF-α等相關炎癥因子的表達及釋放，從而改善心肌炎大鼠的心臟功能[20]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中miRNA-146a表達降低，提示miRNA-146a可能參與了燒沖復合傷所致心臟功能受損的發生及發展過程。與模型組比較，過表達組大鼠心臟功能低下及心肌組織受損得到緩解，心肌組織中炎癥因子水平降低，表明miRNA-146a過表達可抑制燒沖復合傷大鼠心肌炎癥及纖維化變性，并改善其心臟功能，推測miRNA-146可能通過抑制心肌組織中TNF-α、IL-6及IL-1β炎癥因子水平，從而阻止心肌組織炎性反應，較少炎癥介質的產生，達到治療的目的。

JAK是Janus家族成員，STAT是JAK的下游信號因子，可被JAK激活并發生磷酸化，STAT3磷酸化后形成二聚體轉移到細胞核及線粒體內，進而通過轉錄發揮作用，JAK/STAT3信號通路在心肌細胞凋亡、炎性反應、氧化應激等方面發揮重要作用，有研究顯示，激活JAK/STAT3對心肌細胞具有保護作用[21]。XIN等[22]研究發現，激活JAK/STAT3通路可降低急性心肌梗死大鼠的心肌細胞凋亡及心肌組織損傷，對于改善其心臟功能具有一定的積極作用。SAWASHITA等[23]研究發現，JAK/STAT3通路的激活可減輕心肌缺血再灌注損傷，對于心臟具有一定的保護作用。本研究結果顯示，與模型組比較，過表達組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達水平升高；與過表達組比較，聯合組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關蛋白表達降低，提示過表達miRNA-146a可提高燒沖復合傷大鼠心功能，可能是通過激活JAK/STAT3通路減輕心肌組織炎性反應，從而達到改善大鼠心臟功能，促進心肌組織恢復。

綜上所述，miRNA-146a過表達可抑制燒沖復合傷大鼠心肌炎癥及纖維化變性，并改善其心臟功能，可能是通過激活JAK/STAT3通路而實現，但燒沖復合傷大鼠心臟功能損傷的發病機制十分復雜，miRNA-146a對燒沖復合傷大鼠的其他作用機制仍有待于進一步研究。