一種雙歧乳桿菌三聯菌對小鼠免疫功能的調節作用*

趙 婷，馬文明

(山東省濰坊市人民醫院臨床藥學科 261041)

腸道微生物群對于維持腸道免疫平衡和機體健康起著重要作用，腸道內正常微生物群遭到破壞會引起腸道免疫系統的失衡[1]。益生菌制劑具有預防和治療消化道的疾病，因其能幫助機體維持正常的腸道微生物區系、產生抗炎因子、抑制病原菌群生長[1-2]。有研究結果表明，乳桿菌和雙歧桿菌對機體具有重要的免疫調節作用[3]，可有效預防結腸癌、降低血清膽固醇水平等[4]，與人類健康密不可分。而如今臨床抗生素應用欠規范、菌株耐藥嚴重，雙歧桿菌和乳桿菌的益生劑受到了學者們的廣泛關注[5]。乳雙歧桿菌V9(B.lactis V9)是自健康兒童腸道中分離出來的一株雙歧桿菌乳亞種[6]，干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)是2001年從內蒙古自治區錫林郭勒大草原牧民家制作的傳統發酵酸馬奶(koumiss)中分離并篩選獲得的性能優異的益生菌[7]，植物乳桿菌P-8(L.plantarum P-8)是從內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭自然發酵酸牛乳樣品中分離篩選出的性能優良的益生菌[3,8]。以上三類菌株均因其對人工胃液、腸液及膽鹽有良好的耐受性而成為國內外研究熱點[9-10]。近年，有研究表明，益生菌的混合制劑具有更好的免疫調節作用[11-13]。本文重點是在動物實驗模型中探索雙歧乳桿菌三聯菌(B.lactis V9+L.casei Zhang+L.plantarum P-8三聯菌，簡稱BLL)凍干粉的免疫調節作用機制，為BLL的研究開發和真實世界應用提供臨床前實驗證據。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)細胞系：YAC-1細胞、雞紅細胞購自上海源葉生物科技有限公司。(2)實驗動物：雄性C57BL/6J小鼠320只，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物許可證號：SCXK(京)2019-0010]。按照實驗動物飼養要求進行小鼠喂養，飼養員均具備實驗動物人員資格證。該研究內容已獲本院倫理審查小組批準(批號：SRSWLL-2021091802)。(3)實驗益生菌粉：B.lactis V9、L.casei Zhang、L.plantarum P-8菌粉，均為活菌數2 000億/克，購自金華銀河生物科技有限公司(批號分別為20210205001、20210108001、20210123001)。(4)試劑：基礎細胞培養液和試劑盒等材料，如淋巴細胞分離液、0.4%臺盼藍溶液、Hank’s液、RPMI-1640培養基、胎牛血清、刀豆蛋白A(ConA)、NP40(0.1%)、Tris-HCl緩沖液(0.2 mol/L，pH=8.2)及印度墨汁，分別購自美國Gibco公司、北京索萊寶科技有限公司、Sigma公司和碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組及給藥

分別稱取冷凍干燥保存的B.lactis V9、L.casei Zhang、L.plantarum P-8活菌粉，根據質量比，以2∶1∶1的比例無菌雙蒸水進行溶解(即50%B.lactis V9+25%L.casei Zhang+25%L.plantarum P-8)后備用。根據研究內容，將320只小鼠隨機分為8個免疫組，每個免疫組40只，每個免疫組又分別設置對照組(雙蒸水灌胃，n=10)、BLL低劑量組(0.1 mg/kg，n=10)、中劑量組(0.2 mg/kg，n=10)、高劑量組(0.6 mg/kg，n=10)，均為每天0.1 mL/10 g灌胃給藥，連續給藥30 d后處死動物。本實驗嚴格遵循《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003版)中免疫力評價規范執行和分析[14]。

1.2.2小鼠體重及免疫臟器指數的測定

常規飼養小鼠30 d，記錄實驗過程中的一般情況，包括每天觀察和記錄小鼠的一般情況、飲食情況和大小便情況等，給藥期間每周測體重1次。實驗結束(即給藥30 d)，尾靜脈抽取血液，放置4 ℃無菌容器保存備用；然后頸椎脫臼處死所有實驗動物，立即行手術取出胸腺、脾臟等器官，稱重，分別計算和記錄胸腺/體重比值及脾臟/體重比值，置于4 ℃無菌容器保存和備用[15]。

1.2.3ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化實驗

取4 ℃保存的無菌生理鹽水漂洗脾臟2次，將脾臟剪碎成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm組織塊，取脾臟細胞并將細胞濃度調整為3×106個/mL混懸液，將吹打均勻的細胞液加入24孔培養板中，每孔約1.0 mL，培養24 h。然后，待細胞貼壁后，將BLL低、中、高劑量組脾臟細胞給予75 μL ConA/孔(終濃度為7.5 μg/mL)處理，對照組加無菌生理鹽水75 μL/孔處理，繼續培養72 h。實驗結束前4 h棄上清液，每孔吸去多余上清液，同時加入同等量不含血清的RPMI-1640培養基，加入 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液(終濃度0.5 mg/mL)50 μL/孔，培育4 h。棄上清液，每孔加入酸性異丙醇1.0 mL，混均置室溫20 min。酶標儀570 nm波長處讀取光密度(OD)值。最后，用實驗組(即給予ConA試驗孔)OD值減去對照組(即未予ConA實驗孔)OD值，記錄小鼠的淋巴細胞增殖數量[16]。

1.2.4二硝基氟苯(DNFB)誘導小鼠遲發型變態反應(耳腫脹法)

充分暴露小鼠腹部后常規消毒，采用1% DNFB溶液分別在小鼠腹部和右耳均勻涂抹行致敏反應檢測。設置左耳為對照組。敏感反應測試24 h后處死動物，取雙耳片稱重，以雙耳重量之差表示遲發型變態反應(DTH)程度[17]。

1.2.5血清溶血素測定

常規比例(2%，v/v)配置收集好的綿羊紅細胞(SRBC)懸液后，以腹腔注射(ip)方式行免疫反應測試。眼球采血后稀釋300倍，取1.0 mL血液，分別0.5 mL加入10% SRBC和1.0 mL補體，均反應20 min。隨后，在上清液中分別加入都氏試劑3.0 mL。設置SRBC+都氏試劑為對照組。OD=540 nm，計算公式為半數溶血值(HC50)=樣品OD/SRBC半數溶血時的OD×稀釋倍數[18]。給予小鼠低、中、高劑量的BLL 30 d后，腹腔注射2%的SRBC細胞進行免疫，4 d后取血清檢測HC50。

1.2.6抗體生成細胞檢測

同1.2.5方法免疫小鼠，4 d后處死小鼠，無菌取脾臟細胞，生理鹽水稀釋為5 ×106個/mL的脾臟細胞懸液。用Jerne改良玻片法檢測抗體生成細胞數(以空斑數/106脾細胞表示)[19]。

1.2.7小鼠碳廓清實驗

于小鼠尾靜脈注入印度墨汁0.1 mL/10 g，分別從不同時間節點(第2分鐘和第10分鐘)自內眥靜脈叢采血20 μL，加入2 mL 0.1%碳酸鈉(Na2CO3)溶液終止反應。設置Na2CO3為對照組，OD= 600 nm。計算吞噬指數α[19]。

（2）根據已經確定的課程項目，設計所需的工作任務，進而確定課程內容，將橋隧施工及養護的基本知識融于項目和任務之中，寓教于做。

1.2.8小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內法)

以ip方式將20%雞紅細胞懸液注入小鼠體內。于反應30 min后處死動物，收集腹腔清洗液1 mL，分別滴注于2片載玻片上于37 ℃孵育30 min。按照1∶1的比例給予丙酮-甲醇溶液固定細胞，隨后加入濃度控制在4%的Giemsa-磷酸緩沖液行細胞核染色，常規漂洗和晾干后，通過鏡下觀察，分別記錄不同視野中的陽性細胞數，并分析各噬指數和吞噬率[15]。

1.2.9自然殺傷(NK)細胞活性測定

調整靶細胞小鼠淋巴瘤細胞(YAC-1)濃度至4×105個/mL。無菌操作下取小鼠脾臟并制成濃度為2×107個/mL的單細胞混懸液。效應細胞和靶細胞各取100 μL加入96孔板進行培養(效靶比為50∶1)。將YAC-1孔中再加入1%乙基苯基聚乙二醇(NP40)共培養4 h。吸取上清液后1 500 r/min離心5 min，再次吸取上清液加入96孔板中，每孔加入乳酸脫氫酶(LDH)基質液100 μL，反應5 min后加入HCl 30 μL/孔，A490 nm。計算NK細胞活性(%)[15]。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況和臟器指數比較

直至實驗終點，BLL低、中、高劑量組小鼠一般情況尚可，無腹瀉、煩躁等表現，未發現小鼠有中毒癥狀或非特異性死亡現象。給藥30 d前、后，各組小鼠的初始體重與終末體重差值為8.77～10.65 g，4組實驗動物的初始體重和終末體重差值組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，BLL低、中、高劑量組小鼠的脾臟/體重、胸腺/體重比值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠體重及臟器/體重比值比較

2.2 各組小鼠脾淋巴細胞增殖能力及耳郭腫脹度比較

表2 各組小鼠淋巴細胞增殖能力及耳郭腫脹度比較

2.3 各組小鼠吞噬指數α及腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞比較

小鼠碳廓清實驗結果顯示，與對照組比較，BLL中、高劑量組小鼠的吞噬指數α及腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數均明顯升高(P<0.05)。低劑量組小鼠的吞噬指數α及吞噬率和吞噬指數與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠巨噬細胞吞噬功能比較

2.4 各組小鼠HC50及抗體生成細胞比較

BLL低、中、高劑量組與對照組樣品的HC50值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。抗體生成數量檢測結果顯示，與對照組比較，BLL中、高劑量組的空斑數明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)；BLL低劑量組小鼠的空斑數與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組小鼠血清溶血素與抗體生成細胞比較

2.5 各組小鼠NK細胞活性比較

BLL低、中、高劑量組及對照組的NK細胞活性分別為(28.59±10.15)%、(30.54±9.27)%、(36.56±8.45)%、(25.28±10.47)%。與對照組比較，BLL低、中劑量組小鼠的NK細胞活性差異無統計學意義(P>0.05)，而BLL高劑量組小鼠的NK細胞活性明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

眾所周知，乳桿菌屬(Lactobacillus)細菌具備維持腸道微生態平衡、增強腸道的免疫功能的重要作用[16]。研究顯示，給予鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)均能明顯提高小鼠外周血單核細胞吞噬能力[19-20]。此外，研究發現人體腸道分離出的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei ssp.Paracasei)可促進人血液單核細胞分泌白細胞介素(IL)-12，進而參與細胞介導的免疫功能，并調節機體的免疫功能[21-23]。

研究顯示，不同的菌株因細胞壁組成結構及胞外多糖產生代謝產物不同，益生菌的免疫影響也不同[24-25]。B.lactis V9、L.casei Zhang、L.plantarum P-8三者均具有良好的耐酸性和耐堿性，被證實為值得市場開發的有潛力的益生菌[26-27]。本文以動物實驗作為載體，通過檢測和分析BLL處理后的細胞和組織，從動物臟器指數、細胞增殖能力、免疫功能強弱和靶細胞殺傷能力等方面，綜合評定BLL調節免疫功能的作用和機制。

人體免疫器官，如脾臟、胸腺等，是反映人體免疫功能的重要指標，以臟器指數作為單位是衡量免疫功能的初步指標[28]。本研究結果顯示，與對照組比較，BLL低、中、高劑量均對小鼠的體重、脾和胸腺指數無明顯影響，證實了BLL的安全性。但急性毒性、遺傳毒性、亞慢性毒性等還需體內外實驗行進一步驗證研究。

乳酸菌的細胞壁肽聚糖、脂磷壁酸或胞外多糖等成分可對巨噬細胞、NK細胞等效應細胞產生不同的效應。故不同菌株對動物細胞免疫功能、體液免疫功能及吞噬細胞的作用機制各異。T淋巴細胞的轉化率和增殖率可反映免疫細胞功能的強弱，主要是通過ConA誘導其轉化為母細胞而實現[29]。本研究結果顯示，給予ConA處理后，BLL中、高劑量組小鼠的脾淋巴細胞的轉化率明顯高于對照組(P<0.05)，且隨著劑量升高、轉化率也隨之提高。表明BLL可有效提高細胞增殖能力，增強免疫功能。

DNFB誘導的小鼠遲發型變態反應是檢測小鼠細胞免疫功能的另一個重要指標。近年來，關于乳酸菌對遲發型變態反應的影響已有相關報道[30]，但本研究中未發現BLL對DNFB誘導的小鼠遲發型變態反應的影響，主要原因可能是菌株不同而致。

非特異性免疫反應的強弱常通過單核-巨噬細胞功能來反應。本研究結果表明，中、高劑量的BLL可明顯提高小鼠碳廓清功能及小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數(P<0.05)。溶血空斑試驗可用于體外檢測和計數產生IgM及其他類型Ig的抗體生成細胞的數目[31]。本研究結果顯示，中、高劑量BLL能明顯增加溶血空斑數(P<0.05)。以上結果表明，BLL對小鼠單核-巨噬細胞功能和體液免疫功能均有明顯的增強作用。NK細胞在人體內廣泛分布，是機體重要的殺傷淋巴細胞，無須預先致敏就有非特異性殺傷作用，可非特異性殺傷病毒感染細胞、腫瘤細胞等[3]。胞壁酰二肽作為益生菌細胞壁肽聚糖的主要成分，其功能是通過激活巨噬細胞釋放IL-1/IL-6，促進淋巴細胞中的干擾素-γ(IFN-γ)產生，從而提高NK的殺傷力[32]。本研究結果顯示，高劑量BLL可明顯增強NK細胞的活性，根據活化后的NK細胞特點，進一步合成和分泌多種免疫因子，發揮免疫調節及殺傷靶細胞的功能[33]。

綜上所述，BLL可通過增強機體細胞和體液免疫能力、免疫細胞殺傷靶細胞能力，發揮免疫調節功能，為BLL的未來開發和利用提供了臨床前數據支持，其有望發展成為有效增強機體免疫力、值得推廣的益生菌。