泰山白首烏根際土壤真菌多樣性分析

李潔，林瑩，徐美玉，王飛，徐凌川*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355；2.山東御華景宸生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，山東臨沂 273418）

泰山白首烏（Cynanchum bun geiDecne）屬于雙子葉龍膽目蘿藦科植物[1]，是中國特有物種，因其善于增補(bǔ)人體精血、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老，素有“白人參”的美稱。泰山白首烏居泰山四大名藥之首，為山東道地藥材[2]，以塊根入藥，味苦、甘澀，具有補(bǔ)腎益肝、烏須黑發(fā)、養(yǎng)血益精、潤腸通便等功效[3]，富含苯乙酮類、C21甾體皂苷類、萜類和生物堿類等有效成分[4]。該藥材的有效成分和藥理作用[5]成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)之一。隨著其滋補(bǔ)、強(qiáng)身等臨床療效的不斷體現(xiàn)，白首烏藥材的市場也在不斷擴(kuò)大。白首烏為多年生植物，生長周期長，野生品種的開花率和結(jié)果率均較低，而人工種植白首烏較困難[6]，因此，越來越多的偽品植物被用來充當(dāng)正品白首烏使用。為解決這一問題，白首烏的仿野生種植逐漸興起[7]。

植物的生長與土壤環(huán)境的理化因素密切相關(guān)[8]，且受土壤微生物菌落的影響，尤其是根際土壤微生物，對植物的生長發(fā)育起重要作用。根際是指受植物根系影響、離根軸表面數(shù)毫米的微區(qū)域[9]，也是植物、土壤和環(huán)境條件相互作用形成的特定的微生態(tài)系統(tǒng)。根際微生物存在于根際土壤內(nèi)，是根際土壤的重要組成部分。微生物群落的多樣性對植物生長有重要作用[10]，而植物生長過程中產(chǎn)生的分泌物也會影響微生物的種類、數(shù)量和結(jié)構(gòu)，二者間存在協(xié)同互助作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，大部分根際微生物能提高土壤再利用率，促進(jìn)植物生長發(fā)育，且對植物病蟲害有很好的防治效果[12]，增強(qiáng)植物對生物脅迫和非生物脅迫的抗性。任春光等[13]對獼猴桃根際微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌落的種類和數(shù)量對不同生長發(fā)育時(shí)期的幼苗影響不同，不同的菌種對土壤理化性質(zhì)的影響也各不相同。付麗娜等[14]對三七植物根際微生物研究發(fā)現(xiàn)，不同連作年限的三七土壤根際微生物的多樣性和均勻度存在一定差異，且三七根腐病的發(fā)生率與菌落豐富度密切相關(guān)。張艷琪等[15]從泰山白首烏的根際土壤中培養(yǎng)出7株具有抗菌活性的菌株，為研究和開發(fā)新型抗菌藥物提供了原材料和理論指導(dǎo)。因此，探究根際微生物群落的多樣性[16]，對泰山白首烏的人工栽培以及仿野生種植具有重要的理論指導(dǎo)意義，然而，關(guān)于泰山白首烏根際土壤微生物多樣性的研究尚未有報(bào)道。

近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展[17]，高通量測序技術(shù)具有準(zhǔn)確率高、耗時(shí)短、價(jià)格低等優(yōu)勢[18]，被越來越多地應(yīng)用于微生物多樣性分析。因此，本研究通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，以不同產(chǎn)地泰山白首烏的根際土壤為研究對象，對根際微生物的群落組成和分布規(guī)律進(jìn)行分析比較，探討泰山白首烏的生長與微生物菌群結(jié)構(gòu)間的相互聯(lián)系，為更好地創(chuàng)造仿野生種植、培育品質(zhì)優(yōu)良的泰山白首烏提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣地條件

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)樣地。1號樣地：位于山東省萊蕪市蓮花山（LW），海拔999 m，年平均氣溫13.0℃，年降水量1 289 mm。2號樣地：位于山東省濟(jì)南市歷下區(qū)大壩頭（LX），海拔285 m，年平均氣溫13.8℃，年降水量685 mm。3號樣地：位于山東省濟(jì)南市長清區(qū)五峰山（CQ），海拔395 m，年平均氣溫14.7℃，年降水量671 mm。

1.2 土壤樣品采集

采集地的泰山白首烏均為野生種，且由山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為正品原植物。于2021年8月11—13日，選取生長旺盛的植株，用鐵鏟挖至植株根部，用滅菌的刷子和不銹鋼勺收集附著于根系0～4 mm范圍內(nèi)的土樣，每個(gè)樣地分別采集地下10和20 cm深度的根際土樣，分別編號為LW10、LW20、LX10、LX20、CQ10和CQ20，去除大塊顆粒和雜質(zhì)后密封于無菌袋中，冰袋保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 土壤DNA提取 提取DNA前，對樣品進(jìn)行預(yù)處理。稱取300 mg混勻后的土壤樣品，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1×PBS溶液，震蕩混勻，室溫、10 000 r·min-1離心3 min，棄上層液體。將樣品管放入55℃金屬浴10 min，使殘留液體完全揮發(fā)，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。使用OMEGA試劑盒（E.Z.N.A?Mag-Bind Soil DNA Kit）提取根際土壤微生物的總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計(jì)測定其含量和純度，合格的DNA置于-20℃冰箱保存，備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及高通量測序 以提取的總DNA為模板，對基因組ITS1-ITS2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。采用真菌ITS區(qū)的特異性引物（I TS 1 F：5’-CTTGGTCAT TTAGAGGAAGTAA-3’;I T S 2：5’-GCTGCGTTCTT CATCGATGC-3’）進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3 min；94℃30 s，45℃20 s，65℃30 s，5個(gè)循環(huán)；94℃20 s，55℃20 s，72℃30 s，20個(gè)循環(huán)；72℃5 min；10℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格產(chǎn)物用天根膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化后送上海生工生物股份有限公司進(jìn)行Illumina Mi Seq高通量測序。

1.3.3 生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析 將高通量測序得到的序列進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，然后進(jìn)行操作分類單元數(shù)（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于97%相似水平下的OTU聚類和分類學(xué)信息，對OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，并對群落的結(jié)構(gòu)和組成及Alpha多樣性[19-23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 泰山白首烏根際土壤真菌數(shù)據(jù)分析

對泰山白首烏根際土壤6個(gè)樣品的真菌微生物進(jìn)行測序，結(jié)果（表1）表明，樣品LW10、LW20、LX10、LX20、CQ10和CQ20的有效序列數(shù)分別為68 579、68 939、58 106、64 833、49 236和68 679。基于97%相似水平進(jìn)行OTUs聚類分析，共得到1 589個(gè)OTUs。Veen圖（圖1）表明，6個(gè)樣品共有的OTUs為12個(gè)，其中，樣品LW10、LX10和CQ10共有的OTUs為22個(gè)；樣品LW20、LX20和CQ20共有的OTUs為18個(gè)；每個(gè)樣品存在不同數(shù)量的特有OTUs，其中，樣品CQ20特有的OTUs數(shù)量最多，為358個(gè)；樣品LW20特有的OTUs數(shù)量最少，為175個(gè)。

表1 泰山白首烏根際土壤檢測序列結(jié)果Table 1 Sequence results of rhizosphere soil of Cynanch um bun gei Decne

圖1 泰山白首烏根際土壤樣品間Veen圖Fig.1 Veen diagram of rhizosphere soil samples of Cynanch um bungei Decne

2.2 泰山白首烏根際土壤真菌豐富度和指數(shù)多樣性

測序數(shù)據(jù)的稀釋曲線（圖2）表明，隨著樣品測序數(shù)量的增多，Alpha多樣性指數(shù)值變化越來越緩慢，當(dāng)達(dá)到足夠的數(shù)量之后，曲線逐漸趨于平緩，因此，測序深度能夠覆蓋樣品根際土壤中的全部真菌微生物。

圖2 泰山白首烏根際土壤樣品的稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of rhizosphere soil sample of C ynanchum b unge i Decne

Alpha多樣性分析結(jié)果（表2）表明，樣品CQ20的Chao指數(shù)和Ace指數(shù)最高，說明該樣品中根際土壤微生物豐富度較高。樣品LX20的Shannon指數(shù)最大，且Simpson指數(shù)最小，說明該樣品中根際土壤微生物多樣性較高。樣品LX20的Shannon均勻度指數(shù)最大，說明該樣品中微生物在群落分布的均勻度較高。6個(gè)樣品的覆蓋度均為1.0，進(jìn)一步說明測序結(jié)果能夠代表泰山白首烏根際土壤微生物的真實(shí)情況。Rankabundance曲線能夠解釋樣品多樣性的豐富度和均勻度，曲線越寬物種組成越豐富，曲線越平坦物種組成越均勻，對不同樣品進(jìn)行比較，結(jié)果（圖3）表明，樣品LX20的豐富度和均勻度明顯高于其他樣品。

表2 泰山白首烏根際土壤真菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of rhizosphere soil fungal diversity index of Cynanc hum bun gei Decne

圖3 泰山白首烏根際土壤樣品的Rank-abundance曲線Fig.3 Rank abundance curve of rhizosphere soil samples of C ynanch um bungei Decne

2.3 泰山白首烏根際土壤真菌聚類分析和主成分分析

樣本的相關(guān)性熱圖（圖4）表明，同一地點(diǎn)不同深度的樣品間相似性較高，而不同地點(diǎn)樣品間差異較大；樣品LW與LX間的相似性較高，而樣品CQ與LW和LX間的相似性較低。基于Bray-Curtis距離分析樣本間的遺傳距離，結(jié)果（圖5）表明，同一地點(diǎn)不同深度間遺傳距離較小，而不同地點(diǎn)間遺傳距離較大。主成分分析(principal component analysis，PCA)結(jié)果（圖6）表明，不同深度對根際土壤真菌微生物的組成及多樣性影響較小，而不同產(chǎn)地間根際土壤真菌群落的組成存在顯著差異。

圖4 不同根際土壤樣品間的關(guān)系Fig.4 Relationship of different rhizosphere soil samples

圖5 泰山白首烏根際土壤樣品距離熱圖Fig.5 Distance heat map of rhizosphere soil sample of Cynanc hum bun gei Decne

圖6 不同根際土壤樣品間的主成分分析Fig.6 PCA of different rhizosphere soil samples

2.4 泰山白首烏根際土壤真菌的群落組成

6個(gè)樣品的微生物的組成和結(jié)構(gòu)存在較大差異（表3）。其中，樣品LW10的OTUs歸屬于9門、18綱、44目、73科、104屬、167種；樣品LX10的OTUs歸屬于8門、21綱、53目、85科、114屬、171種；樣品CQ10的OTUs歸屬于8門、23綱、49目、86科、130屬、196種；說明不同產(chǎn)地間根際微生物群落的結(jié)構(gòu)組成存在一定差異。與樣品LX10相比，樣品LX20的OTUs歸屬于10門、29綱、60目、106科、142屬、229種，表明不同深度間根際微生物的結(jié)構(gòu)組成及多樣性也存在一定差異。

表3 泰山白首烏樣品在不同分類水平上的數(shù)目Table 3 Number of C ynanch um b ungei Decne samples at different classification levels

2.4.1 門水平 子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、類原生動物門（Rozellomycota）、梳霉門（Kickxellomycota）為6份樣本的共同優(yōu)勢菌門（圖7）。其中，被孢霉門在樣品LW10和LX10的相對豐度較高，分別為58.68%和45.59%；子囊菌門在樣品LW20、LX20、CQ10和CQ20的相對豐度較高，分別為86.84%、53.52%、67.04%和65.80%。另外，各樣品中均包含一定比例的未知菌門。

圖7 不同際土壤樣品真菌在門水平的相對豐度Fig.7 Relative abundance of fungi in different rhizosphere soil samples at phylum level

2.4.2 綱水平 傘菌綱（Agaricomycetes）、古根菌綱（Archaeorhizomycetes）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、盤菌綱（Pezizomycetes）、球囊菌綱（Glomeromycetes）為泰山白首烏根際土壤微生物的優(yōu)勢菌綱（圖8），但在不同土壤樣品中的相對豐度存在較大差異。其中，被孢霉綱在樣品LW10和LX10的相對豐度較高，為58.68%和45.58%；古根菌綱在樣品LW20的相對豐度較高，為81.96%；傘菌綱在樣品LX20的相對豐度較高，為30.05%；糞殼菌綱在樣品CQ10和CQ20的相對豐度較高，分別為52.83%和29.71%。

圖8 不同根際土壤樣品真菌在綱水平的相對豐度Fig.8 Relative abundance of fungi in different rhizosphere soil samples at class level

2.4.3 目水平 在目水平上（圖9），傘菌目（Agaricales）、古根菌目（Archaeorhizomycetales）、球囊霉目（Glomerales）、肉座霉目（Hypocreales）、被孢霉目（Mortierellales）、盤菌目（Pezizales）、糞殼菌目（Sordariales）為優(yōu)勢菌目。其中，被孢霉目在樣品LW10和LX20的相對豐度較高，分別為38.67%和25.85%；古根菌目在樣品LW20的相對豐度較高，為77.29%；傘菌目在樣品LX20的相對豐度較高，為24.94%；糞殼菌目在樣品CQ10的相對豐度較高，為36.70%；盤菌目在樣品CQ20的相對豐度較高，為24.10%。

圖9 不同根際土壤樣品真菌在目水平的相對豐度Fig.9 Relative abundance of fungi in different rhizosphere soil samples at order level

2.4.4 科水平 在科水平上（圖10），古根菌科（Archaeorhizomycetaceae）、中國毛殼菌科（Chaetomiaceae）、內(nèi)杯菌科（Sarcoscyphaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）、赤殼科（Nectriaceae）、核盤菌科（Pezizaceae）和火絲菌科（Pyronemataceae）為優(yōu)勢菌科。其中，被孢霉科樣品LW10和LX10的相對豐度較高，分別為36.67%和32.28%；古根菌科在樣品LW20的相對豐度較高，為75.96%；赤殼科在樣品LX20的相對豐度較高，為24.14%；中國毛殼菌科在樣品CQ10的相對豐度較高，為33.40%；盤菌核科在樣品CQ20的相對豐度較高，為21.75%。

圖10 不同根際土壤樣品真菌在科水平的相對豐度Fig.10 Relative abundance of fungi in different rhizosphere soil samples at family level

2.4.5 屬水平 在屬水平上（圖11），古根菌屬（Archaeorhizomyces）、尾柄孢殼屬（（Cercophora）、赤霉菌屬（Gibberella）、Zopfiella、珠頭霉屬（Oedocephalum）、小被孢霉屬（Mortierella）、冠孢革菌屬（Lindtneria）為優(yōu)勢菌屬。其中，小被孢霉屬在樣品LW10和LX10的相對豐度較高，分別為32.73%和27.93%；古根菌屬在樣品LW20的相對豐度較高，為77.85%；冠孢革菌屬在樣品LX20的相對豐度較高，為23.51%；Zopfiella在樣品CQ10的相對豐度較高，為29.42%；珠頭霉屬在樣品CQ20的相對豐度較高，為21.75%。

圖11 不同根際土壤樣品真菌在屬水平的相對豐度Fig.11 Relative abundance of fungi in different rhizosphere soil samples at genus level

3 討論

高通量技術(shù)能夠準(zhǔn)確、系統(tǒng)、全面地研究土壤微生物群落信息[20-24]。土壤微生物多樣性、豐富度和均勻度等能夠影響土壤質(zhì)量和植物生長。研究表明，土壤根際微生物群落的組成和分布在一定程度上與植物種類、生長年限、海拔高度、土層深度和產(chǎn)地等因素有關(guān)[21]。陳冉等[24]研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物群落多樣性與產(chǎn)地因素關(guān)系密切，主要受生態(tài)區(qū)的氣候和地理位置影響。官鑫等[25]研究報(bào)道，土層深度與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性密切相關(guān)。本研究對不同來源、不同根莖深度的泰山白首烏根際土壤微生物進(jìn)行高通量測序分析，結(jié)果表明，不同來源的泰山白首烏根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在顯著差異性，共有的OTUs僅40個(gè)，群落豐富度和多樣性總體趨勢表現(xiàn)為CQ＞LX＞LW；在群落組成上，LW和LX泰山白首烏根際土壤微生物的優(yōu)勢菌門為被孢霉門（Mortierellomycota），而CQ的優(yōu)勢菌門為子囊菌門（Ascomycota），LW和LX的土壤真菌群落較為接近，表明不同來源泰山白首烏根際土壤的真菌群落多樣性存在較大差異。不同地域的真菌優(yōu)勢群落存在差異，可能與植株的原產(chǎn)生境有關(guān)[26]。土壤理化性質(zhì)的改變和生態(tài)因子的變化會導(dǎo)致部分微生物的生長繁殖受到限制，影響群落的豐富度、多樣性和均勻度；同時(shí)，微生物菌種適應(yīng)環(huán)境變化的能力強(qiáng)弱也會影響群落多樣性[27]。

泰山白首烏在生長過程中，地下根莖會有兩部分橫向生長成膨大的團(tuán)塊狀，該部分是最有藥用價(jià)值的組織部位，深度大約為地下10和20 cm左右。測序結(jié)果表明，不同根莖深度的泰山白首烏根際土壤微生物的群落組成和多樣性存在一定差異，但其優(yōu)勢菌群上差異較小，20 cm土層深度的群落豐富度和多樣性總體表現(xiàn)為20 cm大于10 cm。樣品CQ10和CQ20的優(yōu)勢門、綱均為子囊菌門（Ascomycota）和糞殼菌綱（Sordariomycetes），即不同地下深度的土壤微生物優(yōu)勢菌群具有一定的相似性，這可能與植株在生長過程中與微生物協(xié)同互助有關(guān)[28]，且這類真菌微生物具有分布廣泛、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[29]，直接或間接地影響藥用植物的生長發(fā)育和品質(zhì)形成。不同土層深度土壤的碳源和有機(jī)質(zhì)含量等理化性狀存在一定差異，微生物對不同碳源的利用能力也存在差異，因此，不同深度土壤的微生物群落多樣性存在差異[30]。

植物與根際微生物間存在復(fù)雜的相互作用[31]。根際微生物具有豐富的多樣性，能夠影響植物的光合、呼吸等生理過程，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育及根系功能等[32]。通過改變藥用植物根系分泌物的組成，可有效改善土壤理化性質(zhì)，甚至緩解藥用植物連作障礙[33]。因此，研究不同因素下根際微生物與植物的互作關(guān)系、充分利用微生物的促生機(jī)制提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義[34]，為更好地創(chuàng)造仿野生種植條件、培育品質(zhì)優(yōu)良的泰山白首烏提供科學(xué)且有效的理論指導(dǎo)。