伊犁河谷西天山野果林蘋果巢蛾重要寄生性天敵資源調查*

席歐彥 朱 丹 鐘 問 王晨日 胡紅英

(新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室 烏魯木齊 830046)

蘋果巢蛾(Yponomeutapadella)屬于鱗翅目(Lepidoptera)巢蛾科(Yponomeutidae)巢蛾屬(Yponomeuta)，是歐洲巢蛾復合體(Yponomeutapadellacomplex)中的成員之一，最早在歐洲被發現(Mcdonoughetal., 1990)。目前在加拿大、美國、日本、韓國和中國等均有發生且分布廣泛。在美國發現的蘋果巢蛾為歐洲的入侵物種(Kuhlmannetal., 1998; Leeetal., 2005; Naetal., 2018)； 而該害蟲在中國主要發生于哈爾濱、沈陽、甘肅、內蒙古和新疆等地區，1年均發生1代，危害嚴重(方巖， 2000； 劉壽民等， 2005； 趙連吉等， 2000)。蘋果巢蛾的寄主植物主要包括蘋果(Malusspp.)、山楂(Crataegusspp.)和李子(Prunusspp.)等薔薇科(Rosaceae)植物，其幼蟲對寄主植物危害最為嚴重，大量幼蟲會在葉片和枝條上吐絲結網，許多絲網聚集在一起形成絲巢，導致葉片大量脫落，嚴重時更會造成樹木枯萎死亡(Mowatetal.， 1995)。

伊犁河谷西天山野果林是天山野果林的重要組成部分，是現代栽培果樹的發源地和重要的天然種質資源庫。近年來害蟲大面積爆發，導致西天山野果林森林生態系統遭到嚴重破壞，而蘋果巢蛾的出現也成為了潛在的威脅。寄生性天敵在害蟲生物防治中起到了關鍵性的作用，在害蟲的卵期、幼蟲期或蛹期就可將其致死，達到一種安全有效的生物防治效果。因此，需要選擇合適的寄生性天敵來防治蘋果巢蛾，減輕該害蟲危害的同時保護野果林的生態平衡和生物多樣性。

在生物防治中寄生性天敵起到了重要的作用。崔存儉等(1997)對內蒙古赤峰的蘋果巢蛾生物學特性進行了研究，提出利用保護性天敵的生物防治和化學防治兩種方法對其進行防治。哈米提等(2010)對分布在新疆額敏縣的西天山野果林中的蘋果巢蛾進行了探究，發現其3種寄生蜂，分別為卵到幼蟲跨期寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂，蛹期寄生蜂黃柄齒腿長尾小蜂(Monodontomerusdentipes)和幼蟲到蛹跨期寄生蜂全北群瘤姬蜂指名亞種(Iseropusstercorator)，其中巢蛾多胚跳小蜂為優勢種，但是對寄生蜂的詳細形態特征、雌雄比和羽化過程等均未研究。歐洲對蘋果巢蛾幼蟲和蛹期的寄生蜂也開展了研究，結果發現姬蜂在蘋果巢蛾的生物防治中具有重要的防治潛能(Kuhlmann， 1996； Unruhetal.， 2003)； 土耳其研究者對蘋果巢蛾等4種巢蛾的寄生蜂進行了全面調查發現了15種寄生蜂，其中姬蜂科數目最多，繭蜂科次之，而巢蛾多胚跳小蜂在4種巢蛾中均可寄生(Narmanliogluetal.， 2017)。1987—1997年，加拿大研究者引進了來自歐洲的巢蛾多胚跳小蜂進行田間釋放，統計結果表明該寄生蜂的寄生率可達23%，在一定程度上可以有效地防治蘋果巢蛾(Vincentetal.， 2007)。寄生蜂作為一種重要的生物防治因子在多個國家的蘋果巢蛾防治中已經取得良好的效果。因此，探究蘋果巢蛾的寄生蜂資源可為蘋果巢蛾的生物防治提供參考依據。

我國對蘋果巢蛾寄生性天敵的研究主要是寄生蜂資源的調查，而針對新疆伊犁河谷西天山野果林蘋果巢蛾寄生蜂形態鑒定和寄生生物學的研究幾乎沒有相關報道。因此，本研究主要針對伊犁河谷西天山野果林蘋果巢蛾的寄生性天敵進行調查和分類研究，并探明其優勢寄生蜂的形態特征、寄生率和發育歷期，研究結果為保護西天山野果林寄生性天敵昆蟲多樣性，利用寄生性天敵進行蘋果巢蛾的生物防治提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

1.1.1 供試蟲源 根據伊犁河谷野果林的分布情況，在鞏留、伊寧2個縣野果林集中分布的地區設置采集樣地。每個縣設3塊樣地，樣地大小為50 m×50 m。2016—2017年，在伊寧縣吉爾格朗溝野果林、鞏留縣小莫合鄉野果和鞏留縣大莫合鄉野果林三個地點采集不同發育階段的蘋果巢蛾帶回室內飼養并觀察，將有卵塊的葉片置于玻璃試管20 cm×3 cm，等待羽化。飼養條件為溫度25～30 ℃，RH： 45%～50%，光周期14 L∶10 D。

1.1.2 試驗儀器 RXZ型智能人工氣候箱(寧波江南儀器廠)，SMZ25體視顯微鏡和SM745 T體視變焦顯微鏡(Nikon)； 玻璃試管、脫脂棉和培養皿等(新疆寶信源柏生物技術有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果巢蛾生活史的研究 根據蘋果巢蛾的生物學特性和活動時間，結合當地氣象預報。于2016年對伊犁河谷西天山野果林的蘋果巢蛾進行初步觀察。2017年5—9月，每個月在鞏留和伊寧2個縣的樣地進行定點調查并采集標本，每月采集共計20天左右，并在野外觀察拍照記錄蘋果巢蛾的生活史和危害行為。

1.2.2 蘋果巢蛾寄生蜂的收集與鑒定 野外收集蘋果巢蛾的卵、幼蟲和蛹，光照培養箱中飼養并觀察，之后拍照統計數目。其中，卵塊需每6 h觀察1次，管內適時補充水分。幼蟲每12 h觀察1次，部分幼蟲活性弱，不活躍，蟲體表觀特征異常或者發育明顯晚于同齡個體則很有可能已被寄生，需對其進行針對性觀察，定期計數，并解剖死亡個體。將3頭蛹放入1支玻璃試管內，每6 h觀察1次，并觀察羽化情況，對延遲羽化或不羽化的蛹重點觀察。收集羽化出的寄生蜂，按采集地、采集時間和分類階元將寄生蜂標本保存在無水乙醇中，置于-20 ℃冰箱保存。寄生蜂標本制成針插標本或玻片標本用于分類鑒定，并利用數碼體視顯微鏡拍照。標本均存放于新疆大學生命科學與技術學院昆蟲研究室(ICXU)。

1.2.3 巢蛾多胚跳小蜂的基因組DNA提取及PCR擴增 利用基因組DNA無損傷提取方法，將待測昆蟲標本整體浸入無水乙醇中，并置于-20 ℃的冰箱中至少2 h。制備100 μL體系的緩沖液： 10×PCR Buffer 10 μL、0.45% NP-40 0.5 μL、0.45% Tween-20 0.5 μL、0.6 mg·mL-1Protein K 3 μL、ddH2O 86 μL。挑取完整寄生蜂用蒸餾水清洗后，加入提前配制的緩沖液，50 ℃恒溫水浴鍋中孵育1 h，-20 ℃冰箱靜置約17 h，95 ℃熱激10 min； 將提取完成的DNA放置在-20 ℃的冰箱中保存。COI基因的PCR擴增，引物序列(J1718： GGAGGATTT GGAAATTGATTAGTTCC； N2191： CCCGGTAAAATT AAAATATAAACTTC)，擴增體系總體積為25 μL，包括2×PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板5 μL、ddH2O 6.5 μL。擴增程序為： 95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。擴增產物用1%瓊脂糖膠電泳檢測并由生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.2.4 優勢寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂的發育及羽化 本研究共采集獲得750頭蘋果巢蛾幼蟲和303頭蛹，室內飼養并將幼蟲和蛹分為兩組，每天記錄羽化出的寄生蜂的數目，將每頭幼蟲和蛹中羽化出的寄生蜂數目統計分析，計算出優勢寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂的自然寄生率。隨機選取被寄生的蘋果巢蛾幼蟲100頭分為10個組，每個組10頭進行試驗，觀察巢蛾多胚跳小蜂的羽化全過程，每個過程拍照記錄。羽化過程結束后，統計數目，對巢蛾多胚跳小蜂的雌雄比統計分析。

1.3 數據分析

采用Excel 16.0對蘋果巢蛾的生活史數據統計，巢蛾多胚跳小蜂的雌雄比例統計分析采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0數據處理軟件。

2 結果與分析

2.1 蘋果巢蛾的生活史和形態特征

蘋果巢蛾1年發生1代，以1齡幼蟲在卵殼內越夏、越冬。幼蟲在伊犁河谷4月下旬開始出殼取食葉片，到6月中旬左右為止，約45天。幼蟲分為1～5齡，其中3～4齡幼蟲在5月危害最為嚴重，6月中旬老熟幼蟲不再取食，停留在網巢內吐絲結繭、陸續化蛹。成蟲羽化后，短距離飛行取食，交尾產卵。7月下旬孵化出1齡幼蟲在卵殼內越夏和越冬(表1)。

表1 新疆伊犁河谷西天山野果林蘋果巢蛾生活史①Tab.1 Life history of Y. padella in western Tianshan mountains, Yili valley, Xinjiang

蘋果巢蛾的成蟲體長8～13 mm，體白色并帶有銀色的光澤，觸角為白色絲狀，胸部背面有5個黑色的點狀斑。前翅白色略帶有灰色光澤并有 40個左右的黑色點狀斑，大致排為3列，外緣緣毛為灰褐色(圖1c)。老熟幼蟲體色為灰褐色，體長13.2 mm，頭部單眼成“一”字形，背部有數根剛毛(圖1a)； 蛹的體長為9～10 mm，分散于整個絲巢內結繭化蛹，初化蛹時，頭部、觸角和翅芽為黃色，胸部和腹部為紅色，老熟的蛹為黑褐色，臀部具6根刺(圖1b、d)。

圖1 蘋果巢蛾各齡期形態特征Fig. 1 Morphological characteristics of various developmental stages of Y. padellaa： 幼蟲 Larve； b： 結繭化蛹Pupa； c： 成蟲 Adult； d： 蛹殼 Puparium.

2.2 蘋果巢蛾寄生性天敵資源

在實驗室共飼養得到4種寄生蜂和1種寄蠅(表2)。其中，巢蛾多胚跳小蜂(A.fuscicollis)和選擇盆地寄蠅(Bessaparallela)寄生于蘋果巢蛾幼蟲體內； 齒腿長尾小蜂(Monodontomerussp.)、群瘤姬蜂(Iseropussp.)和長尾嚙小蜂(Apronstocetussp.)是蘋果巢蛾蛹期的寄生蜂。對各寄生性天敵的種類描述如下：

表2 伊犁河谷西天山蘋果巢蛾的采樣點及獲得寄生性天敵種類Tab.2 Species reared from Y. padella collected in Yili valley western Tianshan mountains

2.3 各寄生性天敵記述

生物學： 室內飼養野外采集的蘋果巢蛾蛹，在蘋果巢蛾的蛹殼上發現有長尾嚙小蜂的羽化孔(圖2)。其寄主范圍很廣，包括： 雙翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目和直翅目等(厲向向， 2013)。該寄生蜂為首次記錄的蘋果巢蛾寄生性天敵。

圖2 飼養獲得蘋果巢蛾寄生性天敵—長尾嚙小蜂Fig. 2 Rearing A. sp. from Y. padellaa： 寄主蛹 Pupa； b： 繭和蛹殼 Cocoon and puparium； c： 長尾嚙小蜂蛹 Pupa of A. sp.； d： 長尾嚙小蜂羽化孔 Emergencing holes of A. sp.

圖3 長尾嚙小蜂外部形態特征(♀)Fig. 3 Female adult of A. sp.showing external features(♀)a： 體，側面觀Body, lateral view； b： 頭，正面觀Head, anterior view； c： 觸角Antenna； d： 前翅Forewing； e： 體，背面觀Body, dorsal view.

圖4 長尾嚙小蜂外部形態特征()Fig. 4 Male adult of A. sp. showing external features()a： 體，背面觀Body, dorsal view； b： 頭，側面觀Head, lateral view； c： 中胸，背面觀Pronotum, dorsal view； d： 腹部，背面觀Abdomen, dorsal view.

2.3.2 齒腿長尾小蜂 標本信息： 5♀， 2017-07-05，采集于新疆伊犁地區伊寧縣吉爾格朗溝野果林(海拔： 1 151 m)，室內飼養蘋果巢蛾的蛹獲得(圖5)。

圖5 齒腿長尾小蜂外部形態特征Fig. 5 Adult of M. sp.showing external featuresa： 寄生在寄主蛹期的齒腿長尾小蜂幼蟲Parasitic larvae in Y. padella； b： 齒腿長尾小蜂幼蟲Larvae of M. sp.； c： 體，側面觀Body, lateral view； d： 頭，正面觀Head, anterior view； e： 并胸腹節Propodeum； f： 中胸，背面觀Abdomen, dorsal view.

生物學： 在蘋果巢蛾的蛹殼中獲得齒腿長尾小蜂的幼蟲，幼蟲成淡黃色梭狀(圖5a、b)。主要寄生于膜翅目和鱗翅目的幼蟲和蛹(劉德力， 1990； 胡婷玉等， 2010)。

2.3.3 群瘤姬蜂 標本信息： 5♀， 2017-06-28，采集于新疆伊犁地區鞏留縣大莫合鄉野果林(海拔： 1 357 m)通過飼養蘋果巢蛾的蛹獲得(圖6)。

圖6 群瘤姬蜂成蟲外部特征Fig. 6 The morphological character istics of I. sp.a： 群瘤姬蜂成蟲Adult of I. sp.； b： 頭，正面觀Head, anterior view； c： 翅Wing of I. sp.； d： 觸角Antenna.

生物學： 主要寄生于多種鱗翅目和鞘翅目的幼蟲(劉經賢， 2009)。

2.3.4 巢蛾多胚跳小蜂 標本信息： 5♀， 2017-07-07，采集于新疆伊犁地區伊寧縣吉爾格朗溝野果林(海拔： 1 165 m)通過飼養蘋果巢蛾幼蟲所得(圖7)。

圖7 巢蛾多胚跳小蜂外部形態特征Fig. 7 Adult of showing external features A. fuscicollisa： 頭，正面觀Head, anterior view； b： 腹部，正面觀Abdomen, anterior view； c： 觸角Antenna； d： 翅Wing； e： 足Leg.

COI基因序列： 在NCBI數據庫中上傳巢蛾多胚跳小蜂COI序列(GenBank登錄號為MW523952)。

生物學： 室內飼養獲得的巢蛾多胚跳小蜂，主要寄生于蘋果巢蛾的幼蟲期； 其次，主要的寄主為鱗翅目的卵和幼蟲。

生物學： 寄生于蘋果巢蛾的幼蟲期。主要寄主為鞘翅目瓢蟲科和象甲科； 膜翅目姬蜂科和葉蜂科； 鱗翅目巢蛾科、卷蛾科、蠹蛾科和蛺蝶科等(張春田等， 2018)。

圖8 選擇盆地寄蠅形態特征Fig. 8 Morphological characteristics of B. parallelaa： 蛹殼Puparium； b： 成蟲Adult.

2.4 優勢寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂的發育歷期、寄生率和雌雄比測定

巢蛾多胚跳小蜂多營多胚生殖，將卵產于寄主體內汲取寄主營養物質，寄主被寄生后并不影響其正常的生長發育，1～3齡被寄生的幼蟲取食較緩慢，4～5齡幼蟲會減少食量，最終停止進食而死亡或提前吐絲結繭。在寄主老熟幼蟲期，完成自身發育并鉆孔羽化，最終導致寄主死亡； 被寄生的寄主幼蟲呈棕褐色，全身僵硬似干枯狀，像自然枯死(圖9)。巢蛾多胚跳小蜂雄蜂先羽化，羽化多發生在清晨(7—8時)，在不補充水和營養的條件下，成蜂最長壽命為2天。本試驗采集并飼養蘋果巢蛾數量為130頭，獲得巢蛾多胚跳小蜂119頭，寄生率為91.54%； 其寄主數量為32頭飼養獲得寄生蜂為12頭，寄生率為37.50%，共統計了7組，其平均寄生率為64.52%，為本次調查蘋果巢蛾幼蟲的優勢寄生蜂。

圖9 巢蛾多胚跳小蜂的羽化Fig. 9 Ecolosion of A. fuscicollisa： 被寄生的蘋果巢蛾幼蟲Parasitized larvae of Y. padella； b、c： 放大后的蛹殼Enlarged puparium； d、e： 巢蛾多胚跳小蜂蛹Pupa of A. fuscicollis； f： 巢蛾多胚跳小蜂成蟲Adult of A. fuscicollis.

根據10個組羽化出的巢蛾多胚跳小蜂雌雄數據統計，10個組分別用1～10來編號(圖10)。結果表明，同一批羽化出的巢蛾多胚跳小蜂的雌雄主要分為3種情況，即全為雌蜂、全為雄蜂或雌雄蜂均有。巢蛾多胚跳小蜂的雌蜂數量明顯高于雄蜂，雌蜂數量占比均在78%以上，雌雄性比約為3.5∶1。

圖10 巢蛾多胚跳小蜂的羽化數量Fig. 10 The emergence number of A. fuscicollis百分比為每組雌蜂數量與每組寄生蜂總數量的比值。The percentage is the ratio of the number of females in each group to the total number of parasitic wasps in each group.

3 討論

新疆西天山伊犁河谷水土條件優越，保存了大量的原始針葉林、野蘋果和野核桃等多種重點保護植物，但是卻受到蟲害的威脅。利用寄生性天敵進行生物防治是控制自然生態系統中許多害蟲生長的重要方法，也是保護野生樹木的重要手段之一。蘋果巢蛾是一類重要的食葉害蟲，對野果林中野生果樹的危害也逐年加重，因此需要對蘋果巢蛾的寄生性天敵進行研究。首先對蘋果巢蛾的形態特點和生活史進行描述，了解該害蟲的發育歷期，通過對蘋果巢蛾生活史的調查發現其在幼蟲期對果樹的危害最為嚴重，今后可在害蟲的卵到幼蟲期進行重點防治，從而產生較好的防治效果； 其次對飼料蘋果巢蛾所獲得的5種寄生性天敵進行分類鑒定，可為后續蘋果巢蛾寄生性天敵的鑒定提供參考資料。本試驗進一步確定巢蛾多胚跳小蜂為蘋果巢蛾幼蟲期寄生蜂，而且寄生率為64.52%，此結果與前人研究結果基本一致(哈米提等， 2011)，不同之處在于本次研究中所發現的5種寄生性天敵，其中的長尾嚙小蜂為其蛹期寄生蜂，而該寄生蜂是首次在蘋果巢蛾中被發現。長尾嚙小蜂主要寄生于該害蟲的蛹中，每頭蛹出蜂42～61頭且雌蜂比雄蜂數量多，而國內外對長尾嚙小蜂的研究表明其可寄生于美國白蛾的蛹、桑天牛卵(楊忠岐等， 2003)和臺灣的刺桐樹(Erythrina)(Yangetal., 2014)，也可寄生于象甲科昆蟲的卵(Jacasetal., 2005)。由于長尾嚙小蜂的寄主種類多樣，且在生物防治中的效果顯著，后續可對其寄生生物學進行更深入的研究，確定寄生能力和防治潛力。

優勢寄生蜂巢蛾多胚跳小蜂在其羽化過程中發現雄蜂先于雌蜂羽化，雌蜂占比在78.5%以上，且存在產雌孤雌生殖和產雄孤雌生殖現象，產生此現象的原因與寄主的大小、雌蜂與寄主的相遇幾率、飼養溫度和光周期、產卵時雌蜂個體的營養等外在因素相關(Clearyetal., 2004)，該生殖方式對后代的繁殖和延續均有積極影響，也對人工擴繁有重大意義。Lee等(2007) 發現巢蛾多胚跳小蜂在蘋果巢蛾幼蟲的不同齡期表現出不同的寄生率，且寄生率的高低還會受到溫度和寄主生長的影響。因此，在后續大量人工擴繁巢蛾多胚跳小蜂的過程中，需要考慮到寄主的齡期，確定合適的外界條件從而獲得更多的寄生蜂，達到更好的防治效果。

在研究過程中發現，對寄生性天敵的鑒定方面仍存在一定困難。1) 長尾嚙小蜂屬是姬小蜂科中極大的屬，世界范圍內已知有813個種且在NCBI數據庫中種的分子信息也極少，從屬鑒定到種較為困難； 2) 室內飼養獲得的齒腿長尾小蜂和群瘤姬蜂這2類寄生蜂與哈米提等研究者報道的雖為同一個屬，但是經過傳統形態學的比較，證明了它們并非同一個種，后續會使用整合分類學對其進行研究，鑒定至種； 3) 室內飼養出的巢蛾多胚跳小蜂為優勢寄生蜂，但是巢蛾多胚跳小蜂需要通過制作玻片標本進行形態鑒定，過程較復雜。如出現標本殘缺時，無法通過形態進行鑒定，可通過DNA條形碼技術解決殘缺標本鑒定的問題。由于巢蛾多胚跳小蜂的COI基因序列在NCBI數據庫及BLOD數據庫中均未被報道，因此，在本研究中通過擴增該寄生蜂的COI基因獲得了巢蛾多胚跳小蜂的基因序列，并將其上傳至數據庫，目前該基因序列在NCBI和BLOD數據庫中均可查到，后續只需提取DNA擴增COI基因進行序列比對，就可以確定是否為巢蛾多胚跳小蜂，為物種的鑒定提供參考。綜上所述，對寄生性天敵的鑒定方面盡管存在一些困難，但是利用一些新的技術方法，可以解決大部分問題。在今后可以同時利用形態分類和分子DNA條形碼(Perryetal.， 2019)等鑒定方法進行物種分類，通過與國內外的專家進行交流學習，將蘋果巢蛾的寄生性天敵鑒定到種級水平。

寄生蜂雖然個體微小，卻在害蟲的生物防治中扮演重要角色。目前，我國對蘋果巢蛾的防治主要還是以傳統的化學防治和農業防治為主。化學防治見效快但會對其他的野生保護植被造成影響，建議可采用化學防治與生物防治相結合的綜合防治方法，比如噴灑農藥時可利用寄生蜂群落的消長動態，避開寄生蜂高峰期(6月)，選擇低毒和無殘留農藥進行該害蟲防治。西天山野果林是重要的果樹起源地，其野生果樹資源尤為重要，整體的環境保護對寄生蜂資源的多樣性及開發和利用有著非常重要的作用，所以天敵昆蟲資源的研究就顯得尤為重要。利用寄生性天敵對西天山野果林的蘋果巢蛾進行防治，目前只是處于基礎研究階段，對寄生蜂的分子鑒定以及擴繁和林間釋放尚有待進一步研究。

4 結論

本研究從蘋果巢蛾幼蟲和蛹中飼養獲得4種寄生蜂和1種寄蠅，其中巢蛾多胚跳小蜂為優勢寄生蜂且對蘋果巢蛾的幼蟲寄生能力較強，而長尾嚙小蜂為首次記錄的蘋果巢蛾寄生蜂。蘋果巢蛾幼蟲期對伊犁西天山野果林危害最為嚴重，因此在幼蟲期進行防治尤為關鍵，采用生物防治的手段，既可保護珍貴的野生果樹資源又可以擴大寄生蜂的數量確保寄生蜂資源豐富度。因此，本研究為我國蘋果巢蛾的生物防治提供科學依據，并建議應當利用本土寄生性天敵保護西天山野果林的野生果樹資源。