巨桉金屬耐受蛋白EgMTP6的分子特征及功能*

韓麗娜 謝賢安 陳 輝 唐 明

(嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室華南農業大學林學與風景園林學院 廣州 510642)

鋅(Zn)作為生物的必需元素，是大量酶和調節蛋白中的催化或結構輔助因子(Maret, 2009)。但鋅過量積累不僅造成植物中毒，生長受抑制(Barceletal., 1990)，還可導致植株根部缺乏磷營養(Dingetal., 2021)。為了維持體內鋅平衡，植物在細胞水平上構建了包括吸收、外排、螯合、轉運和儲存鋅的網絡，如陽離子擴散輔助蛋白家族(cation diffusion facilitator, CDF)，根據結構特異性和轉運底物的種類，分為Zn-CDF、Zn/Fe-CDF和Mn-CDF 3個二價金屬轉運蛋白類群(Montaninietal., 2007)。植物CDF又稱為金屬耐受蛋白(metal tolerance protein, MTP)，基于擬南芥(Arabidopsisthaliana)12個MTP基因的分類，植物MTP分為7個組(Gustinetal., 2011)。

MTP作為膜轉運蛋白可將重金屬離子轉運到細胞器儲存或外排至胞外，從而影響植物對重金屬的耐受性(Gustinetal., 2011)。擬南芥中AtMTP1突變后對鋅敏感(Kobaeetal., 2004)，過表達AtMTP3增強植株對鋅的耐受性(Arrivaultetal., 2006)，過表達水稻(Oryzasativa)OsMTP1的酵母對鋅的耐受性增強(Yuanetal., 2012)。不同重金屬處理時，香橙(Citrussinensis)部分MTP表達量發生變化(Fuetal., 2017)。在不同組織和不同生長時期，葡萄(Vitisvinifera)MTP差異表達(Shirazietal., 2019)。MTP在草本植物中的功能已有大量研究，但在木本植物中的功能研究較少。

巨桉(Eucalyptusgrandis)生長快速，適應性強，為紙漿和硬木的生產提供原材料(Myburgetal., 2014)。此外，桉樹可以吸收土壤中的重金屬，降低自然排水系統中的重金屬含量，減少礦山土壤的重金屬污染(Maitietal., 2017)。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)與植物共生能夠緩解重金屬對宿主的毒害，香樟(Cinnamomumcamphora)接種幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum)緩解鋁脅迫(閆明等， 2007)，刺槐(Robiniapseudoacacia)與摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)共生鉛耐受指數顯著提高(Huangetal., 2019)，紫穗槐(Amorphafruticosa)與摩西斗管囊霉共生過程中檢測到與重金屬結合的膜聯蛋白和金屬硫蛋白，這些蛋白有效地減輕重金屬對植物的毒害(宋福強等， 2014)。

桉樹是典型的菌根樹種，接種摩西斗管囊霉的桉樹苗生物量增加，Cu和Zn的含量顯著性降低，細胞壁對鉛的滯留和液泡對鉛的隔離作用增強(廖妤婕等， 2014)。本研究篩選到一個巨桉金屬耐受蛋白，命名為EgMTP6，對其生物信息學特征、亞細胞定位、鋅轉運功能和表達模式進行分析，研究其在緩解鋅脅迫中的作用，為進一步揭示磷、AMF與EgMTP6相互作用響應鋅脅迫的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試微生物 1) 根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101化學感受態細胞，購于上海唯地生物技術有限公司。2) 釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)野生型BY4741和鋅轉運蛋白突變體zrc1Δ，購于歐洲酵母突變體庫。3) 異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)DAOM 197198孢子懸液，由華中農業大學安建勇博士(購于法國阿格瑞植物營養公司Agronutrition，Toulouse)惠贈。孢子懸液以白車軸草(Trifoliumrepens)為宿主富集培養3個月(唐明等， 2019)，將含有白車軸草根系、根外菌絲和孢子的混合物作為菌劑，孢子密度為15 個·mL-1，侵染率為63.3%。

1.1.2 供試植物 巨桉種子購于廣州匯森林業有限公司。2% NaClO滅菌16 min，無菌水清洗5次； 置于1/4 MS(Murashige-Skoog)培養基上，25 ℃暗培養3天，種子萌發后移至培養室培養14天； 將生長狀態一致的巨桉幼苗移至裝有白沙(121 ℃滅菌2 h)的花盆(80 mm × 80 mm × 80 mm，121 ℃滅菌20 min)中培養14天，每天澆25 mL含300 μmol·L-1NaH2PO4的Long-Ashton營養液(Hewitt, 1966)。培養室培養條件為： 16 h光照/8 h黑暗，光強度5 000 lx，溫度25 ℃，濕度60%。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同鋅濃度和不同磷濃度分別處理巨桉實生苗 選取生長狀態一致的巨桉幼苗，分別用含ZnSO4(5、50、500 μmol·L-1)(Fuetal., 2017)，NaH2PO4(30、300、3 000 μmol·L-1)(Fanetal., 2020)的Long-Ashton營養液(Hewitt, 1966)處理，每個處理5 株，培養42天后，取根部鮮樣于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 巨桉實生苗接種異形根孢囊霉 選取生長狀態一致的巨桉幼苗，接種處理組在巨桉根部附近接種15 mL菌劑； 對照組加入15 mL滅菌的菌劑，用含30 μmol·L-1NaH2PO4的Long-Ashton營養液處理(Hewitt, 1966)。取樣方法同1.2.1。

1.2.3 巨桉根系異形根孢囊霉定殖情況 接種異形根孢囊霉的巨桉根系，參照Xie等(2016)方法使用熒光麥胚凝集素488對菌根樣品染色。熒光顯微鏡觀察異形根孢囊霉的定殖情況，統計定殖率和叢枝豐度(Trouvelotetal., 1986)。

1.2.4 基因克隆 稱取1 g巨桉根部冷凍樣品，提取總RNA(Perottoetal., 2014)。反轉錄采用HiScriptIII第一鏈cDNA合成試劑盒(+gDNA wiper，Vazyme，南京)，EgMTP6片段擴增使用Phanta高保真聚合酶(Vazyme，南京)，具體流程參照說明書，擴增引物如表1。

1.2.5 生物信息學分析 ExPASy分析基因序列特征，SACS HMMTOP預測蛋白跨膜結構，SWISS-MODEL預測蛋白3D模型，MEGA11.0構建系統進化樹，GENEDOC進行氨基酸序列比對。

1.2.6 煙草葉表皮亞細胞定位 農桿菌介導的本氏煙(Nicotianatabacum)葉表皮亞細胞定位和檢測方法參照Pan等(2016)。表達載體為含有綠色熒光蛋白的pCanG-N(35 S∷eGFP)，內質網標記基因(HEDL∷mCherry)作為對照，片段合成引物如表1，激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光和紅色熒光。

1.2.7 釀酒酵母中異源表達 酵母突變體互補方法參照Ai等(2009)，表達載體為pFL61，片段合成引物如表1。

1.2.8 不同處理表達量分析 利用實時熒光定量PCR分別檢測不同濃度鋅、不同濃度磷和異形根孢囊霉對巨桉EgMTP6表達量的影響，以巨桉泛素體蛋白基因(EgUBI3)為內參(定量引物如表1)，使用熒光定量專用預混液(SYBR qPCR Master Mix，Vazyme，南京)，Bio-Rad iQ5檢測EgMTP6的表達量，采用2-ΔΔCt處理結果。

表1 所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in this work

2 結果與分析

2.1 EgMTP6的序列特征

在NCBI中進行同源比對，從巨桉基因組中得到與AtMTP6(NP_182304.2)相似性為64%的蛋白序列，命名為EgMTP6?；蝾A測顯示EgMTP6含有一個長度為1 524 bp的開放閱讀框，包含12個外顯子和11個內含子，編碼507個氨基酸(圖1A)。瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得克隆片段的大小(圖1B)。蛋白理化性質預測結果顯示，EgMTP6相對分子質量為55.39 kD，理論等電點為6.48，屬于堿性蛋白?？缒そY構預測顯示：EgMTP6的氨基端位于膜內側，羧基端位于膜外側，含有5個跨膜螺旋，在TMIII和TMIV螺旋之間是一個富含組氨酸的區域，位于TMII的HSVSD基序與連接TMV和TMIV環中的HHRAD基序是Fe/Zn-CDF特異性的基序(圖1C)。3D模型預測顯示:EgMTP6由2個亞鐵離子外排泵(ferrous iron efflux，FieF； 模板SMTL ID： 3h90.1.A)組成。FieF的主要功能是通過膜轉運Zn2+和Cd2+(Cotrimetal., 2019)，因此推測EgMTP6具有轉運鋅的功能。

圖1 EgMTP6的基因和蛋白結構特征Fig. 1 Structure features of EgMTP6A. ATG： 起始密碼子；TGA： 終止密碼子；黑色方塊： 外顯子；灰色線條： 內含子； B. 凝膠電泳檢測PCR擴增產物的大??； C. HD motifs 用箭頭表示；TMI-TMV： 跨膜結構域；N： 氨基端；C： 羧基端； D. 以3h90.1.A為模版構建EgMTP6的3D模型。A. ATG: Start codon; TGA: Stop codon; Black box: Exons; Gray lines: Introns; B. PCR-amplified product were gel electrophoresed; C. HD motifs were indicated by arrows; TM1-TM5： Transmembrane domain; N:-NH2; C:-COOH； D. The 3D model of EgMTP6 was constructed with 3h90.1.A as template.

2.2 EgMTP6的保守性分析

以NCBI和植物基因組數據庫中的AtMTP及OsMTP(Yuetal., 2018)，高粱(Sorghumbicolor)SbMTP6(XP_021307383.1)、毛果楊(Populustrichocarpa)PtMTP6 (POPTR_0002s20980)、黃瓜(Cucumissativus)CsMTP6(APM86801.1)、葡萄VvMTP6(GSVIVG01010968001)、香橙CitMTP6(Cs5g32700.1)和EgMTP6(KCW49998.1)構建系統進化樹(圖2)。植物CDF家族分為3個類群： Zn-CDF、Zn/Fe-CDF和Mn-CDF。Group1、Group5和Group12組成Zn-CDF。Group6和Group7組成Zn/Fe-CDF，Group8和Group9組成Mn-CDF。EgMTP6與CitMTP6相似性最高，與AtMTP6、CsMTP6、PtMTP6、VvMTP6、CitMTP6、OsMTP6、SbMTP6均屬于Group6，歸為Zn/Fe-CDF類群。對MTP6的蛋白序列進行比對(圖3)，發現MTP6具有較高的相似性，并且都含有FieF結構域和HD-HD基序，說明EgMTP6在進化和結構上具有保守性。

圖2 EgMTP6的系統進化關系Fig. 2 Phylogenetic relationship of EgMTP6

圖3 MTP6多序列比對Fig. 3 Multiple sequence alignment of MTP6FieF用黑色框表示；HD motif用紅色線條表示。 The FieF was indicated by a black box; The HD motif were indicated by red line.

2.3 EgMTP6在煙草葉表皮細胞的定位

EgMTP6融合eGFP表達后注射煙草葉表皮，并與內質網標記蛋白(HEDL)進行共定位，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果見圖4。對照組eGFP(35 S∷eGFP)在細胞核、細胞膜和細胞質中都可以觀察到綠色熒光(圖4A)，說明該定位系統在煙草葉表皮細胞中可以有效表達。融合表達EgMTP6的eGFP(35 S∷eGFP∷EgMTP6)在細胞核中不能觀察到綠色熒光(圖4B)，但細胞核周圍的絲狀放射線顯示綠色熒光，部分細胞膜呈不連續綠色熒光，這些是蛋白定位內質網的特征(Panetal., 2016)，并且綠色熒光在與內質網標記蛋白的紅色熒光(HEDL∷mCherry)完全重合，說明EgMTP6定位于煙草葉表皮細胞的內質網。

圖4 EgMTP6的亞細胞定位Fig. 4 Subcellular localization of EgMTP6A. 35S∷eGFP的熒光信號； B. EgMTP6與內質網標記蛋白(HEDL∷mCherry)共定位的熒光信號； GFP：綠色熒光通道； BF：明場； GFP+BF：綠色熒光通道與明場疊加； mCherry：紅色熒光通道； GFP+mCherry：綠色熒光通道與紅色熒光通道疊加. 標尺，50 μm。A. the green fluorescence protein of 35S∷eGFP。 B. fluorescence of co-transfering with endoplasmic reticulum marker (HEDL∷mCherry) of EgMTP6; GFP: Green fluorescence protein channe; BF: Bright field; GFP+BF: Green fluorescence protein channel overlapped with bright field; mCherry: Red fluorescence protein channel; GFP+mCherry: Green fluorescence protein channel overlapped with red fluorescence protein channel. Bar: 50 μm.

2.4 EgMTP6在釀酒酵母中的表達

zrc1Δ是釀酒酵母BY4741缺失液泡膜鋅轉運蛋白的突變體，可以將鋅轉運至液泡中儲存(Lietal., 1998)，在BY4741和zrc1Δ中表達EgMTP6研究其轉運鋅的能力。點斑試驗結果顯示，在不添加和分別添加10和15 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培養基上zrc1Δ和zrc1Δ-EgMTP6長勢沒有顯著差異。但在含有20 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培養基上，BY4741長勢良好，而zrc1Δ不能生長(圖5)，說明Sczrc1將過量Zn2+轉運至液泡中，可緩解胞質中過量Zn2+對BY4741生長的抑制。zrc1Δ-EgMTP6在含有20 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培養基上可以生長，長勢弱于BY4741，但顯著強于zrc1Δ，說明EgMTP6部分恢復了zrc1Δ轉運鋅的功能。因此，在釀酒酵母中，EgMTP6部分恢復突變體zrc1Δ的遺傳缺陷，作為鋅轉運蛋白，可將胞質中過量的鋅轉運到液泡中。

圖5 EgMTP6在釀酒酵母中的表達Fig. 5 Expression of EgMTP6 in S. cerevisiae

2.5 鋅、磷和異形根孢囊霉對EgMTP6表達的影響

2.5.1 鋅、磷對EgMTP6基因表達的影響 熒光定量PCR結果顯示，不同濃度(5、50和500 μmol·L-1)ZnSO4的營養液培養巨桉時，隨著鋅濃度的升高，EgMTP6的表達量呈現上升趨勢，但差異不顯著(P< 0.05)(圖6A)，說明EgMTP6的表達不受鋅濃度調控。用含低濃度(30 μmol·L-1)和中等濃度(300 μmol·L-1)磷的營養液培養巨桉時，EgMTP6的表達量無顯著差異； 但在高濃度(3 000 μmol·L-1)磷處理時，EgMTP6的表達量是低濃度磷處理的1.9倍，是中等濃度磷處理的2.2倍，差異顯著(P< 0.05)(圖6B)，說明EgMTP6的表達不受低濃度和中等濃度磷的影響，但受高濃度磷的誘導。

圖6 不同濃度鋅或磷處理時EgMTP6的表達Fig. 6 Expression of EgMTP6 with various levels of zinc or phosphorus concentration

2.5.2 異形根孢囊霉對EgMTP6表達的影響 對接種和未接種異形根孢囊霉的巨桉根樣品染色后在熒光顯微鏡下觀察，非菌根樣品中無侵染結構，菌根樣品中可觀察到清晰的叢枝和根內菌絲(圖7A)，侵染率為65.75%，叢枝豐度為49.2%(圖7B)，表明異形根孢囊霉達到有效侵染。以組成型表達的EgUBI3為內參，檢測接種異形根孢囊霉(AM)和未接種異形根孢囊霉(NM)巨桉根系中EgMTP6的表達量。在轉錄水平上，EgMTP6的表達量在菌根組織中與非菌根組織中相比，差異顯著(P< 0.05)(圖7C)，說明異形根孢囊霉侵染巨桉根系顯著誘導EgMTP6的表達。

圖7 異形根孢囊霉對EgMTP6表達的影響Fig. 7 Effect of AMF on EgMTP6 expressionA. 異形根孢囊霉定殖形態，a： 叢枝，ih： 根內菌絲； B. 異形根孢囊霉定殖情況，F%： 侵染率，A%： 叢枝豐度； C. 異形根孢囊霉對EgMTP6表達的影響，AM： 菌根，NM： 非菌根。A. colonization morphology of AMF, a: Arbuscules, ih: Intraradical hyphae; B. AMF colonization, F%: The frequency of colonization, A%: The abundance of arbuscule abundance; C. Effect of R. irregularis on EgMTP6 expression, AM: AMF colonized roots, NM: AMF uncolonized roots.

3 討論

3.1 EgMTP6結構和進化的保守性

以AtMTP6序列為模版，在NCBI中檢索到2條蛋白序列，相似性為99.8%，僅存在一個氨基酸差異，將與AtMTP6同源性較高的序列命名為EgMTP6。EgMTP6跨膜結構與經典的6個跨膜螺旋有所不同(Montaninietal., 2007)，這種差異可能是由于EgMTP6中HHRAD motif在跨膜螺旋外側造成的。EgMTP6為Fe/Zn-CDF類群，可轉運Zn2+、Co2+、Cd2+、Ni2+等二價金屬離子(Montaninietal., 2007)。與EgMTP6位于同一分支上的AtMTP6在大腸桿菌(Escherichiacoli)中過表達，大腸肝菌在含有1 mmol·L-1ZnSO4的培養基中能正常生長，但過表達AtMTP6的大腸桿菌生長受抑制，推測AtMTP6將Zn2+轉運到胞質內，造成細胞內Zn2+過量，抑制大腸桿菌生長(吳平治等， 2006)。MTP6分支上的蛋白均具有FieF結構域和HD-HD基序，細菌CDF家族的YiiP蛋白最早被稱為FieF，作為膜蛋白參與轉運Zn2+和Cd2+(Cotrimetal., 2019)。x射線分析大腸桿菌 YiiP蛋白，發現分別位于第二和第四的跨膜螺旋的HD motif是金屬結合位點(Luetal., 2007)。EgMTP6同時具有FieF結構域和HD-HD基序，在進化關系和結構上都具有保守性，推測EgMTP6可以轉運Zn2+。

3.2 EgMTP6是定位在內質網的鋅轉運體

植物MTP蛋白多定位于細胞的膜系統(Gustinetal., 2011)，AtMTP2位于內質網，可將胞質內過量鋅轉運至內質網(Sinclairetal., 2018)。磷轉運蛋白AtPHO1在煙草葉表皮細胞中表達定位在高爾基體，高濃度磷處理表達AtPHO1的煙草葉片時，部分AtPHO1轉移到質膜上，促進磷的外排(Arpatetal., 2012)。OsMTP11在煙草葉表皮細胞中定位在高爾基體，但在高濃度錳脅迫時，OsMTP11從高爾基體網狀結構移動到質膜，通過胞吐的方式把錳轉運到膜外，緩解過量錳造成的脅迫(Maetal., 2018)。植物某些轉運蛋白受到生物或非生物脅迫時，在細胞內的定位發生改變以適應相應的脅迫。煙草亞細胞定位結果表明，EgMTP6定位于煙草葉表皮細胞的內質網，參與鋅在胞質與內質網之間的轉運。

酵母PMR1是定位在高爾基體的錳轉運蛋白，負責將胞質中錳運輸到高爾基體，增強酵母對錳的耐受性(Tonetal., 2002)。定位在液泡膜的OsMTP8能回補pmr1Δ，恢復pmr1Δ對錳的耐受性，表明OsMTP8是錳轉運蛋白(Erogluetal.， 2016)。zrc1Δcot1Δ是酵母液泡膜鋅轉運蛋白雙突變體，對鋅敏感，位于內質網的AtMTP2能回補zrc1Δcot1Δ，恢復zrc1Δcot1Δ對鋅的耐受性，表明AtMTP2作為鋅轉運蛋白將細胞內過量鋅轉運至內質網(Sinclairetal., 2018)。敲除zrc1的酵母突變體zrc1Δ對鋅敏感(Lietal., 1998)，在zrc1Δ中表達EgMTP6后，zrc1Δ能在含有20 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培養基上生長，但長勢弱于BY4741，表明zrc1Δ中鋅轉運蛋白的功能得到部分恢復，進一步證明EgMTP6是鋅轉運蛋白。

研究還發現，部分MTP在轉錄水平上不受轉運底物濃度調控。AtMTP11在維持細胞內錳穩態和耐受性方面發揮重要作用，但其表達量不受錳濃度的調控(Delhaizeetal., 2007)。CsMTP5與CsMTP12以異源二聚體形式轉運鋅，過量鋅條件下，CsMTP5的表達受到抑制，鋅缺乏時，CsMTP5表達受到誘導； 而CsMTP12的表達不受鋅濃度變化的影響(Migockaetal.， 2018)。EgMTP6的表達在轉錄水平上不受鋅濃度調控，可能在轉錄后水平或翻譯水平調控鋅的轉運。

3.3 磷、AMF與EgMTP6的相互關系

一些作物體內的磷和鋅的積累呈負相關，鋅含量隨磷的施用而降低，而施鋅使磷含量降低(Dingetal., 2021)。Bouain等(2014)發現隨著磷濃度的增加，萵苣(Lactucasativa)根部鋅濃度降低，說明植物磷含量調控對鋅的吸收。因此，施加磷肥可以降低植物對鋅的吸收，從而緩解過量鋅對植物的毒害作用。植物不僅可以通過減少對鋅的吸收降低細胞內的鋅含量，還可以將鋅轉運到細胞器或胞外降低胞質中鋅含量。EgMTP6是定位于內質網的鋅轉運蛋白。低濃度和中等濃度磷處理時，EgMTP6表達量無顯著變化； 高濃度磷處理時，EgMTP6表達量顯著增加，推測細胞內磷含量的增加，促進胞質鋅到內質網的轉運，降低胞質中鋅含量。

AMF通過菌根途徑為宿主提供90%的磷(Van der Heijdenetal., 2008)。Zhang等(2017)發現玉米(Zeamays)形成菌根后，根部出現磷積累、鋅缺乏。AMF可以通過增加宿主的磷營養來調控宿主體內的鋅含量。Burleigh等(2003)報道蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtZIP2具有吸收鋅的功能，接種AMF時MtZIP2表達量下調，根部的鋅含量降低，說明AMF抑制MtZIP2的表達，降低對鋅的吸收。AMF通過增加宿主的磷營養來調控宿主鋅轉運相關基因的表達。接種異形根孢囊霉后，EgMTP6表達量升高，異形根孢囊霉為巨桉提供磷，促進胞質內過量鋅轉運至內質網。因此，在巨桉菌根中異形根孢囊霉通過為宿主提供磷，誘導EgMTP6表達，進而促進胞質中鋅轉運至內質網，降低胞質中鋅含量，緩解高鋅脅迫。

4 結論

EgMTP6屬于Fe/Zn-CDF家族，編碼507個氨基酸，包含12個外顯子和11個內含子。蛋白氨基端位于細胞內，羧基端位于細胞外，且包含5個跨膜結構和HD-HD基序。EgMTP6是位于內質網的鋅轉運蛋白，但EgMTP6的表達不受鋅濃度影響。高濃度磷和異形根孢囊霉誘導EgMTP6的表達。EgMTP6在分子特征和功能方面的研究將有助于進一步探討該基因在巨桉菌根耐受重金屬的分子機制。