內生真菌對新渡戶樹蜂共生真菌的抑制作用*

王立祥 崔樹鵬 孔露露 王 萱 楊宗基 任利利 駱有慶

(1.甘肅農業大學植物保護學院 蘭州 730070； 2.北京林業大學林木有害生物防治北京市重點實驗室 北京 100083)

森林昆蟲能與真菌在長期協同進化中形成互相依存的互惠共生關系，即真菌協助昆蟲生長發育和適應環境，昆蟲則是真菌長期穩定的棲息場所和傳播載體(Peteretal.， 2020)。這種共生關系不僅使共生菌與宿主昆蟲形成穩定的營養共同體，而且有利于“蟲菌共生類”昆蟲快速占據較多生態位，成為優勢類群(Biedermannetal.， 2019)。

新渡戶樹蜂(Sirexnitobei)隸屬于膜翅目(Hymenoptera)樹蜂科(Siricidae)樹蜂屬(Sirex)(盧鐘寶， 2018)，是一種重要的林木鉆蛀性害蟲(Gaoetal.， 2021)，在我國河北、北京、內蒙古、吉林、遼寧、甘肅、陜西、江蘇、云南等地均有分布(盧鐘寶等， 2018)。該蟲寄主廣泛，可危害多種針葉樹種，在不同地區其危害的寄主樹種有所差別，主要包括油松(Pinustabulaeformis)、華山松(Pinusarmandii)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、落葉松(Larix)等。有別于一般鉆蛀性害蟲僅直接鉆蛀樹木造成危害，新渡戶樹蜂具有特殊的“昆蟲-共生真菌”復合致害寄主樹種的能力(王明等， 2020)。一般來講，樹蜂屬昆蟲與共生真菌形成嚴格的一一對應關系，1種樹蜂僅攜帶1種共生菌(Tabataetal.， 1997； 1999； Slippersetal.， 2003)。如松樹蜂(Sirexnoctilio)的共生真菌為Amylostereumareolatum，蘭樹蜂(S.cyaneus)的共生真菌為A.chailletii。然而，Fitza等(2016)研究發現日本地區的新渡戶樹蜂攜帶2種共生真菌，為A.chailletii或A.areolatum，且認為寄主樹種是影響新渡戶樹蜂共生真菌差異的主要原因。

新渡戶樹蜂的雌成蟲體內形成了1對特化的器官——貯菌囊，專門用來貯藏共生菌的分生孢子和菌絲片段。貯菌囊位于雌成蟲產卵器基部，與中輸卵管相連。新渡戶樹蜂雌成蟲產卵時會將卵和貯菌囊內的共生菌菌絲片段和孢子一起注入寄主樹木內(Taylor， 1981)。完成產卵后，蟲卵需要等待一段時間才能孵化，此時共生菌菌絲片開始在寄主內大面積生長，它作為一種白腐真菌，能夠降解寄主木質纖維素，破壞木質部結構，為初孵幼蟲的取食做準備(Thompsonetal.， 2013； 2014)。研究認為，共生真菌對新渡戶樹蜂幼蟲而言是不可或缺的，它為幼蟲的生長發育提供了必要的營養和活動空間，如果共生真菌在寄主樹木內生長受限，新渡戶樹蜂也將發育不良，甚至死亡(李大鵬， 2015)。然而，新渡戶樹蜂幼蟲在寄主內生長時會面臨許多資源競爭者。研究發現，A.chailletii和A.areolatum生長速率緩慢，競爭資源和生態位的能力很弱，能被寄主樹木內已定殖的真菌所抑制(Wahl， 2017)，從而破壞新渡戶樹蜂與共生真菌的互利共生關系，影響新渡戶樹蜂幼蟲在寄主內的生長發育(Wangetal.， 2019)。

前期研究發現在寄主樟子松內有許多死亡的新渡戶樹蜂幼蟲，尸體已被真菌侵染。幼蟲是否因為寄主內生真菌侵染致死尚不明確。于是本文提出1個假設，即卵幼蟲死亡的原因是寄主樟子松的內生真菌抑制了新渡戶樹蜂共生真菌的生長，進而導致幼蟲無法取食而死亡。本試驗選取的2種真菌大伏革菌(Phlebiopsisgigantea)和綠色木霉(Trichodermaviride)均分離自樟子松內死亡的樹蜂幼蟲體表，為優勢真菌。且前期研究發現，這2種真菌也是樟子松的優勢內生真菌(王立祥等， 2017)。因此，本文以新渡戶樹蜂的共生真菌為研究對象，研究寄主樟子松和油松體內新渡戶樹蜂共生真菌的種類差異性，比較2種優勢內生真菌對新渡戶樹蜂共生真菌拮抗能力的差異，并對其拮抗機制作初步探討，研究結果以期為新渡戶樹蜂的生物防治提供新思路和依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1) 2種供試內生真菌大伏革菌和綠色木霉保存于甘肅農業大學植物保護省級重點實驗室，其在GenBank上的基因登錄號分別為KX099661和KX099655。

2)新渡戶樹蜂共生真菌A.chailletii和A.areolatum分離自雌成蟲貯菌囊。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同寄主樹種新渡戶樹蜂共生真菌的檢出率 2018年4月下旬，在內蒙古通遼市金寶屯鎮東風營林區新渡戶樹蜂發生地分別選取有典型點狀流脂且有個別樹蜂新鮮羽化孔的樟子松和油松各5株，樹齡為20～25年，胸徑18～24 cm。將供試樣木伐倒后，截成1 m的木段，兩端封蠟以防止水分散失，隨之寄回甘肅農業大學養蟲室。不同蟲害木被分別放置在養蟲籠中，保持養蟲室內的溫度為(25±3) ℃，濕度為65%±5%，光照條件為自然光照，直到新渡戶樹蜂成蟲自然羽化。由于該地區的樟子松同時也被松樹蜂危害，因而所取樣木也可能存在松樹蜂，但2種樹蜂的羽化時間存在差異。待樹蜂羽化期，收集新渡戶樹蜂雌成蟲，解剖貯菌囊，分離共生真菌，并統計不同寄主樹種內新渡戶樹蜂的2種共生真菌檢出率。

1.2.2 真菌的生長速率測定 將得到的優勢內生真菌綠色木霉和大伏革菌以及新渡戶樹蜂的共生真菌A.chailletii和A.areolatum分別接種至PDA培養基上活化1周，后用直徑4 mm的打孔器取活化好的菌餅，接種至新的PDA平板中心位置，并放置在黑暗條件下25 ℃恒溫培養。測量菌絲生長直徑的方法為十字交叉法： 在培養皿背部每隔24 h標記菌絲生長的最前沿，測量菌落直徑，并求其平均值，待菌絲生長到培養皿邊緣時停止測量。然后計算測量的平均值，每種真菌重復5次。用以下公式計算真菌的生長速率。

GR=TLH/GD×100%。

式中：GR為真菌生長速率(mm·d-1)，TGLH為菌絲生長總長度(mm)，GD為生長天數(d)。

1.2.3 內生真菌與共生真菌的平板對峙試驗及鏡檢 利用平板對峙法來衡量內生真菌對共生菌A.chailletii和A.areolatum的拮抗能力。首先將所有真菌接種于PDA培養基上活化1周，然后用滅過菌的直徑為4 mm真菌打孔器進行打孔，由前期生長速率試驗結果可知，共生真菌A.areolatum的生長速率明顯慢于內生真菌。為使它們有相對公平的競爭起點，按如下方法接種： 首先在PDA培養基的平板中心接種共生菌A.areolatum，待A.areolatum生長4天后，在其培養基平板直徑的兩側距邊緣20 mm處分別接入內生真菌菌餅；A.chailletii的生長速率與2種內生真菌生長速率無差異，故同時接種。每個處理重復3次，以僅接種4 mm菌餅的A.chailletii和A.areolatum作為對照。計算內生真菌對A.areolatum和A.chailletii菌絲生長的抑制率，計算公式如下：

式中：P為抑制率，C、T分別為對照組、對峙試驗中的A.chailletii和A.areolatum菌落半徑，d為菌餅的半徑。

在平板對峙試驗過程中，用小刀片刮取2菌落交界處的菌絲體，制成臨時玻片，在顯微鏡下觀察二者菌絲體的生長及相互影響情況。

1.2.4 內生真菌發酵液對共生真菌孢子萌發的影響 內生真菌發酵液的制備(陳曼等， 2008)： 將2株優勢內生真菌在PDA平板上活化1周后，無菌條件下用直徑4 mm的真菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅。將菌餅分別接種到含有150 mL PDB(葡萄糖3 g； 馬鈴薯30 g； 蒸餾水150 mL)液體培養基的三角瓶中，每個三角瓶接種5個菌餅，于25 ℃、180 r·min-1培養10天。得到的培養液以5 000 r·min-1離心10 min并取上清液，經過0.22 μm的微孔濾膜真空抽濾，收集發酵濾液，4 ℃保存備用。

將2種共生真菌A.areolatum和A.chailletii分別接種于PDA培養基，10天后用滅菌打孔器打取5 mm菌餅挑于無菌試管中，加入2 mL 0.01%的Tween-80無菌水沖洗、振蕩攪動使培養基的真菌孢子盡可能多的存在于無菌水中。然后取1滴孢子懸浮液于顯微鏡下觀察，在低倍鏡下(10×10)每個視野內孢子數達到60～100個即可。無菌條件下，取制備好的孢子懸浮液300 μL加入2 mL的滅菌離心管中，加入等體積的不同稀釋倍數的內生真菌發酵液(原液，5、10、20、50倍液)，再加入200 μL的PDB液體培養基，對照組只加入等量無菌水，振蕩混勻。每個處理重復3組，25 ℃恒溫培養8 h，鏡檢孢子萌發情況，并計算抑制率。

1.3 數據分析

統計分析軟件使用SPSS 23.0。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對真菌生長速率、平板對峙和發酵液試驗中測定參數進行分析，多重比較使用Tukey HSD檢驗法。Pearson卡方檢驗用于分析不同寄主樹種中新渡戶樹蜂雌雄蟲的數量差異，以及2種共生真菌A.chailletii和A.areolatum的檢出率差異。

2 結果與分析

2.1 不同寄主樹種新渡戶樹蜂羽化數及其共生真菌的檢出率

從樣木中共羽化新渡戶樹蜂成蟲490頭。由圖1可知，不同寄主樹木中，新渡戶樹蜂雌蟲與雄蟲羽化數量差異均顯著(樟子松：χ2=54.08，df=1，P<0.01； 油松：χ2=87.12，df=1，P<0.01)，其中從樟子松中羽化新渡戶樹蜂163頭，雌成蟲39頭； 從油松中羽化新渡戶樹蜂327頭，雌成蟲56頭。不同寄主中，雌蟲體內分離到的共生真菌種類也存在差異。在樟子松中，39只雌蟲共分離共生真菌39株，其中A.chailletii分離到24株，A.areolatum分離到15株(χ2=10.48，df=1，P<0.05)。在油松中，56頭雌蟲共分離共生真菌53株，A.chailletii分離到19株，A.areolatum分離到34株(χ2=8.91，df=1，P<0.05)，且本次分離發現，每頭雌成蟲只能攜帶1種真菌，A.chailletii或A.areolatum。

圖1 不同寄主樹木中新渡戶樹蜂的羽化數量(A)和新渡戶樹蜂雌成蟲分離不同共生真菌的菌株數(B)Fig. 1 The number of emergences of S. nitobei in different host trees (A) and the number of strains of different symbiotic fungi isolated from female adults of S. nitobei (B)*： P<0.05，**： P<0.01.

2.2 不同真菌的生長速率

由圖2可知，4種真菌的生長速率存在顯著差異(F=329.99, df=3,P<0.05)。在相同的培養時間下，內生真菌綠色木霉的生長速率最快，菌落直徑為(10.13±0.16) mm·d-1； 大伏革菌的生長速率次之。相比于2種內生真菌，新渡戶樹蜂共生真菌的生長速率均較慢，其中A.areolatum的生長速率最慢，為(4.26±0.2) mm·d-1。大伏革菌和A.chailletii的生長速率無顯著差異(F=3.28, df=2,P>0.05)。

圖2 4種真菌的生長速率Fig. 2 The growth rate of four fungi圖柱上不同小寫字母表示生長速率在0.05水平下差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters above columns indicate a significant difference at 0.05 level (P<0.05).

2.3 內生真菌對共生真菌的抑制作用

平板對峙結果表明： 2種內生真菌對新渡戶樹蜂共生真菌A.chailletii和A.areolatum的生長均具有較強的抑制作用(F=84.1, df=3,P<0.01)(圖3)。接種內生真菌1周后，綠色木霉對2種內生真菌的抑制率均大于60%； 大伏革菌對A.areolatum的抑制率為40.16%，而對A.chailletii的抑制率最強，為85.79%(圖3A)。接種2周后，內生真菌對共生真菌的抑制作用顯著增強，抑制率均超過85%(圖3B)，但整體而言，綠色木霉抑制新渡戶樹蜂共生真菌的能力強于大伏革菌。由試驗結果可知，當綠色木霉和大伏革菌的菌絲剛接觸A.chailletii和A.areolatum的菌絲時，A.chailletii和A.areolatum并沒有明顯變化； 但在菌絲接觸1～2天后，可觀察到接觸帶的菌絲纏繞在一起，并略微上凸； 菌絲接觸3～4天后，接觸帶發生塌陷，培養基背面可觀察到明顯的抑菌帶(圖4)。在拮抗后期，發現綠色木霉和大伏革菌的菌絲體均可完全地覆蓋A.chailletii和A.areolatum菌落，持續觀察20天，檢測發現A.chailletii和A.areolatum均無活性，說明綠色木霉和大伏革菌均能完全抑制新渡戶樹蜂共生真菌的菌絲生長并導致其死亡。其中A.areolatum在受到綠色木霉和大伏革菌的抑制后，菌落由起初的無色逐漸變為黃色，到拮抗后期變為較深的黃褐色，而A.chailletii此現象不明顯(圖4)。

圖3 內生真菌對共生真菌生長的抑制作用Fig. 3 Effects of endophytic fungi on the growth of symbiotic fungiA： 為接種內生真菌1周后的抑制率； B： 為接種內生真菌2周后的抑制率。A： The inhibition rate of endophytic fungi was 7 days after inoculation; B: The inhibition rate of endophytic fungi was 14 days after inoculation.

圖4 內生真菌對共生菌菌絲的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effect of endophytic fungi on hyphae of symbiotic fungi大伏革菌與A. areolatum正面(A)、背面(B)對峙； C: 綠色木霉與A. areolatum正面(C)、背面(D)對峙。大伏革菌與A. chailletii正面(E)、背面(F)對峙； 綠色木霉與A. chailletii正面(G)、背面(H)對峙。P. gigantea vs. A. areolatum front(A), back (B); T. viride vs. A. areolatum front(C), back (D); P. gigantea vs. A. chailletii front(E), back (F); T. viride vs. A. chailletii front(G), back (H).

由鏡檢結果可知，內生真菌菌絲體以多種方式抑制共生真菌的菌絲生長，可與共生菌菌絲平行生長、寄生、纏繞在共生菌菌絲上(圖5A、C、D)，也可使共生真菌菌絲發生畸形(圖5C、D)，有的還能穿入共生真菌菌絲內生長(圖5B)。

圖5 內生真菌對共生真菌生長的影響Fig. 5 Effects of endophytic fungi on the growth of symbiotic fungiA： A. areolatum(Aa)和T. viride(Tv)的菌絲拮抗(纏繞及畸形)； B： A. chailletii(Ac)和T. viride的菌絲拮抗(寄生)； C： A. chailletii和P. gigantea(Pg)的菌絲拮抗(畸形)； D： A. areolatum和P. gigantea 的菌絲拮抗(纏繞)。A: Antagonistic mycelia of A. areolatum (Aa) and T. viride (Tv) (entangulation and deformity); B: Antagonistic mycelia of A. chailletii (Ac) and T. viride (parasitism); C: Antagonistic mycelia of A. chailletii and P. gigantea (Pg) (deformity); D: Hyphae antagonism of A. areolatum and P. gigantea (entanglement).

2.4 內生真菌發酵液對共生真菌孢子萌發的影響

2種內生真菌發酵液對新渡戶樹蜂共生真菌A.chailletii和A.areolatum的分生孢子萌發均有抑制作用，且不同菌株的發酵液對不同共生真菌分生孢子萌發的抑制作用差異顯著。從表1可以看出，內生真菌發酵產物的濃度越高，對孢子萌發的抑制率越高，其中綠色木霉的發酵原液對A.chailletii和A.areolatum的孢子萌發抑制率均最高，分別為42.06%和46.19%。隨著內生真菌發酵液濃度降低，其抑制率也隨之降低，2種內生真菌發酵液表現出相同的抑制趨勢。整體而言，綠色木霉發酵液對A.chailletii和A.areolatum孢子萌發的抑制能力高于大伏革菌發酵液。

表1 內生真菌發酵液對共生真菌分生孢子萌發的抑制作用①Tab.1 Inhibitory effect to fermentation filtrate sprepared from endophytic fungi on conidiophores germination of A. chailletii and A. areolatum

①TVF： 綠色木霉發酵液； PPF： 大伏革菌發酵液。同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。TVF: Fermentation filtrates ofT.viride; PPF: Fermentation filtrates ofP.gigantea. Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05).

3 討論

昆蟲與真菌在長期協同進化過程中形成了相互依存的共生關系(王四寶等， 2017)，即昆蟲可為真菌提供棲息場所，真菌配合宿主昆蟲完成各階段的生命活動(薛寶燕等， 2004)。多數樹蜂科昆蟲能與淀粉韌革菌屬(Amylostereum)真菌共生。一般來說，1種樹蜂只攜帶1種共生真菌，它們之間有著穩定的共生關系。截至目前，樹蜂科昆蟲已有報道的共生菌種類共有4種，分別為A.chailletii、A.areolatum、A.ferreum和A.laevigatum(王立祥， 2019； 李大鵬等， 2015； Slippersetal.， 2015)。以往研究認為，1種真菌可以分別與不同種樹蜂形成共生關系。然而，近來的研究發現，不同地區的同種樹蜂可攜帶不同的共生真菌種類(Fitzaetal.， 2016)。本研究結果顯示，新渡戶樹蜂能攜帶2種共生真菌A.areolatum或A.chailletii，但同一種寄主松樹羽化的樹蜂雌蟲攜帶共生真菌的比例有差別。其中在油松中羽化的雌成蟲攜帶A.areolatum的比例更高，樟子松中羽化的雌成蟲攜帶A.chailletii比例更高。由此可見，新渡戶樹蜂攜帶共生菌的種類與它所侵染寄生樹種有關。本研究結果與日本學者的研究結果相同(Fitzaetal.， 2016)，證實了樹蜂與其共生真菌并不遵循嚴格一一對應的理論。早在1970年，歐美學者已指出寄主樹種可能是淀粉韌革菌屬真菌與不同種樹蜂關聯的重要驅動因素，如A.chailletii常與松屬(Pinus)之外的其他松科(Pinaceae)植物相關聯，而A.areolatum常與松科的松屬樹種相關聯(Prattetal.， 2000)。但這一觀點不是固定不變的，樹蜂攜帶的共生菌會隨著寄主樹種和時間的變化而變化。例如本試驗中樟子松和油松均屬于松屬樹種，但新渡戶樹蜂不僅攜帶A.areolatum，而且也攜帶A.chailletii。綜上所述，在以后的研究中，將結合多種真菌鑒定手段和擴大調查樹蜂寄主種類，從采樣地和采樣量2個維度考慮，探究我國新渡戶樹蜂共生菌A.areolatum或A.chailletii與不同寄主樹種之間的關系，將簡單的“樹蜂-共生真菌”固化關系轉變為“寄主樹種-樹蜂-共生真菌”三者之間的動態關系。

大伏革菌和綠色木霉都屬于腐生菌，可在朽木上大量繁殖，通過營養競爭、重寄生、分泌次級代謝物質及誘導寄主植物產生抗性等多種方式防治植物病蟲害的發生(張曉夢等， 2020)。本試驗所選取的優勢內生真菌大伏革菌和綠色木霉對新渡戶樹蜂2種共生真菌的生長均有較強的抑制作用。平板對峙試驗發現，大伏革菌和綠色木霉的菌絲體在PDA培養基上會顯著侵占共生菌的生存資源和空間，通過營養掠奪、纏繞和寄生等方式使共生菌生長不良，最終會完全覆蓋共生菌并導致其死亡。在發酵液試驗中，2種內生菌發酵液對共生菌孢子萌發均有抑制作用，且綠色木霉發酵液抑制效果優于大伏革菌發酵液。隨著內生真菌發酵液濃度降低，其抑制率也隨之遞減。從這個理論角度出發，可以認為寄主樹種內綠色木霉和大伏革菌定殖率越高，其對新渡戶樹蜂侵染的抗性能力越強(王立祥， 2019)。

大伏革菌對針葉樹根腐病有很好的防治效果，目前已研制出大伏革菌的商品化制劑(李杏春等， 2014)，它不僅能夠控制已發病的樹木，還能有效地防控周圍樹木感染，并且對生態環境的影響較小。僅在歐洲，每年約有62 000 hm2的歐洲云杉(Piceaabies)使用大伏革菌菌劑(Thor， 2003)。相較于大伏革菌，綠色木霉的生防作用早已被各國科學家所證實，木霉菌制劑對于一些土傳病原菌都有很好的防治效果，如立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、鐮刀菌(Fusariumspp.)、核盤菌(Sclerotiniaspp.)、疫霉菌(Phytopthoraspp.)等。早在1981年，防治果樹銀葉病的木霉菌制劑已經在西歐國家商品化生產，在我國江浙一帶有用木霉菌防治茉莉花(Jasminumsambac)白絹病的報道(劉士旺， 2003)。其中的綠色木霉可對松落針病病原菌有較好的抑制效果(祁金玉等， 2014)。新渡戶樹蜂作為一種次期性害蟲，嚴重危害衰弱的針葉樹。本試驗結果發現，綠色木霉和大伏革菌能夠抑制并殺死新渡戶樹蜂共生真菌，破壞樹蜂與共生真菌的互惠共生關系。在今后的生產實踐中，可以在樹蜂產卵前期，對衰弱木采取樹干注射、灌根、飛機施藥等方法施用綠色木霉和大伏革菌的生物菌劑，使這些真菌提前占據生態位，抑制樹蜂共生真菌生長，降低產卵率和幼蟲成活率，達到害蟲防治效果。這種防治方法對我國入侵害蟲松樹蜂等其他樹蜂昆蟲也同樣有效。

4 結論

本研究從樟子松中死亡樹蜂幼蟲體表分離的優勢內生真菌大伏革菌和綠色木霉對新渡戶樹蜂共生真菌A.chailletii和A.areolatum均具有顯著的抑制作用，其中平板對峙試驗中2株內生真菌可完全抑制并殺死新渡戶樹蜂共生真菌的菌落。寄主樟子松對新渡戶樹蜂及其共生真菌的入侵與定殖有一定的抵抗能力。本試驗結果為新渡戶樹蜂的生物防治提供了菌株資源，為樟子松內生真菌的開發利用奠定了基礎。