單細胞結構和電學特征檢測方法

梁紅雁 陳德勇③ 王軍波③ 陳 健*③

①(中國科學院空天信息創新研究院傳感技術國家重點實驗室 北京 100190)

②(中國科學院大學電子電氣與通信工程學院 北京 100049)

③(中國科學院大學未來技術學院 北京 100049)

1 引言

單細胞生物物理學特征主要包括結構特征(如細胞直徑和細胞核直徑)和電學特征(細胞膜比電容和細胞質電導率)。其中，細胞與細胞核直徑反映細胞形態特征，細胞膜由磷脂雙分子層和膜蛋白組成，通常等效為電容模型，細胞質由基質、骨架和內容物組成，通常等效為電阻模型，其數值的變化與其組成結構、數量的改變有關。目前，已有研究表明，單細胞結構和電學特征變化與血液細胞生理病理機制[1–8]、腫瘤細胞惡性程度[9–16]以及干細胞分化階段[17–23]密切相關。

單細胞結構和電學特征檢測存在細胞體積微小難以操縱、缺乏有效模型支撐等難度。面對這些難度，發展的單細胞結構和電學特征常規檢測方法主要分為兩類：固定式和流動式。固定式檢測方法包括膜片鉗、電旋轉和介電電泳等，可檢測數十、百個細胞的細胞膜比電容、細胞質電導率和細胞直徑等固有參數，但存在細胞操縱復雜、檢測通量低等問題，無法獲取具有統計學意義的大量單細胞數據。而流動式檢測方法包括電阻抗、光散射和光成像等，可獲取細胞及細胞核直徑等參數，但無法同時收集細胞電學特征等參數，使其應用受限。

近年來，隨著MEMS(Micro-ElectroMechanical Systems)迅速地發展，微流控技術，即在微通道中對微尺度流體的控制技術[24]，由于特征尺寸(～μm)與細胞尺寸相匹配，已經成為表征單細胞結構和電學特征的一種有效工具[25]。基于該技術的方法較為明顯地提高了檢測通量，可檢測成千上萬細胞的結構和電學參數，但仍存在檢測參數少等問題，限制了細胞的綜合評估。

在此背景下，本文綜述了以上不同單細胞結構和電學特征檢測方法，主要分為固定式、流動式及基于微流控的方法。針對這些方法的原理、發展和主要優缺點進行了闡述分析和對比總結，同時探討了單細胞結構和電學特征檢測所面臨的問題，以及發展研究的方向。

2 固定式檢測方法

常規的單細胞結構和電學特征的固定式檢測方法主要是基于頻率掃描的原理，將細胞固定在待測區域，通過施加電信號，記錄細胞的頻率響應，再基于相應的等效模型轉換為細胞的固有電學特征，如細胞膜比電容和細胞質電導率等，同時，可利用成像獲取細胞的結構特征。這類方法主要包括膜片鉗、電旋轉和介電電泳等。

2.1 膜片鉗

膜片鉗檢測單細胞電學特征的工作原理如圖1(a)所示[26，27]。該方法是將細胞膜的一部分吸入微移液管尖端以形成高電阻密封，通過將微移液管尖端電極施加的電流解釋為頻率的函數，即可獲得等效的細胞膜電容。

作為這一領域的先驅者，Neher等人[28–30]使用全細胞膜片鉗研究單細胞電學特征，評估了細胞處于靜息狀態下的等效膜電容約為幾皮法(pF)，而細胞進入胞吐過程(將細胞內的物質運出的過程)中，等效膜電容以0.01 pF逐步變化。后續膜片鉗進一步發展，主要表現在以下4個方面：(1)雙頻激勵信號的應用[31，32]；(2)計算機系統的集成[33，34]；(3)測量噪聲的詳細分析[35，36]；(4)系統的自動化[37，38]。

作為一項成熟的技術，膜片鉗已經成為表征單細胞電學特征的金標準。該方法雖然可以精確評估細胞膜電容，但由于高度依賴微移液管的精準操作以及與目標細胞形成高阻封接，造成了檢測通量過低的問題，僅獲取來自十幾或幾十個細胞的電學特征數據。因此膜片鉗無法從大量細胞中獲取數據，從而使其在細胞分類分型等應用上受限。

2.2 電旋轉

電旋轉檢測單細胞電學特征的工作原理如圖1(b)所示[39，40]。在電旋轉中，基于麥克斯韋-瓦格納(Maxwell-Wagne)極化原理，施加的旋轉電場使懸浮的單細胞旋轉，通過測量旋轉速率對施加頻率的響應來量化單細胞的細胞膜介電常數和細胞質電導率。

作為該領域的先驅，Zimmermann等人[41，42]利用電旋轉研究單細胞電學特征，表征了紫菜葉肉單細胞、不同酸堿條件下的類囊體囊泡單細胞的膜比電容分別為～0.48， 0.93(pH=8.1)和0.77 μF/cm2(pH=4.4)。后續電旋轉在表征單細胞膜電容方面的進一步發展，主要體現在以下3個方面：(1)高頻電場中的模型擴展[43，44]；(2)計算機輔助數據處理[45–46]；(3)自動化操作[47–50]。

作為一項成熟的技術，電旋轉已經被廣泛應用于單細胞電學特征檢測領域。該方法報道的電學特征參數差異證明了與腫瘤發展[9，51，52]和血液疾病相關[53，54]，然而仍存在高度依賴對目標細胞的精確操作，導致檢測通量有限的問題。盡管后續致力于提高細胞操作速度[47–50]，但仍只能獲取數百個單細胞的電學特征數據，不能得到具有統計學意義的單細胞電學特征差異。

2.3 介電電泳

介電電泳檢測單細胞電學特征的工作原理如圖1(c)所示[40]。在介電電泳中，施加電信號的電極使細胞附著其上，獲取細胞數量關于頻率的函數，然后通過克勞修斯-莫索提因子(Clausius-Mossotti Factor， CMF)頻譜曲線擬合將其轉化為細胞膜比電容。

圖1 固定式檢測方法

作為該領域的先驅，Labeed等人[55]利用介電電泳表征細胞電學特征，報道了人類髓性白血病細胞(K562)及其耐藥性細胞的膜比電容和細胞質電導率分別為0.82 μF/cm2和0.23 S/m(K562)、0.76 μF/cm2和0.50 S/m(耐藥性K562)；此外表征了人乳腺癌細胞(MCF-7)及其不同耐藥基因表達細胞(MCF-7 TaxR， MCF-7 DoxR和MCF-7 MDRl)的細胞質電導率分別為0.23，0.14，0.40和0.27 S/m。

介電電泳作為一種基于細胞群體檢測的方法，相對于膜片鉗和電旋轉來說，操作簡便，但在檢測過程中鄰近細胞之間相互作用的潛在問題無法得到適當的解決，同時采集的頻譜是基于群體細胞層面，所以轉化的特征是細胞群體的平均性能，而不是單個細胞的電學特征。

綜上所述，檢測單細胞結構和電學特征的固定式方法均可獲取細胞固有的電學特征參數，但存在無法表征單細胞層面性能(如介電電泳)或者檢測通量低(如膜片鉗和電旋轉)等問題，難以采集具有統計學意義的大量單細胞數據用于細胞評估。

3 流動式檢測方法

針對固定式單細胞結構和電學特征檢測方法通量低的主要問題，發展了常規的流動式方法，驅動單個細胞依次流動通過檢測區域，引起電信號或者光信號的產生或變化，以此為依據，轉換為細胞的電參量或結構特征參數。這類方法主要包括電阻抗、光散射和光成像等，目前據此形成的兩大類重要儀器，流式細胞儀和血細胞分析儀，已經被應用于生物醫學領域，作為大部分細胞的分類和狀態評估，具有廣闊的市場價值和應用前景。

3.1 電阻抗

電阻抗檢測單細胞結構和電學特征的工作原理如圖2(a)所示[56]?；趲鞝柼卦恚瑧腋≡陔娊庖旱募毎ㄟ^小孔時取代相同體積的電解液，導致小孔兩側電極間電阻發生瞬時變化，產生電位脈沖，通過脈沖信號的大小和次數反映細胞大小和數目。

作為該領域的先驅，文獻[57，58]利用電阻抗研究單細胞結構和電學特征，測量了單細胞通過小孔的直流電脈沖，轉換為細胞體積，用于白細胞3分群(淋巴細胞、單核細胞和粒細胞)；隨后，在直流的基礎上加入交流成分，額外表征了單細胞的細胞膜和細胞質部分的電學特征，初步應用于白細胞5分類(淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞)[59，60]。

作為細胞計數金標準的技術，基于庫爾特原理的電阻抗提供了一種對細胞直徑(體積)及細胞粒度進行測量的方法。相對傳統顯微鏡細胞觀察分析，電阻抗能夠快速、準確地獲取細胞大小和數量，但仍無法獲取細胞核直徑等結構特征參數以及細胞膜比電容和細胞質電導率等固有電學特征參數，導致其在單細胞分析領域功能受限。

3.2 光散射

光散射檢測單細胞結構特征的工作原理如圖2(b)所示[56]。在光散射中，穿行的單細胞被激光照射，并與部分光子發生碰撞，使光子的運動方向發生改變而向不同角度散射。通過記錄激光中斷次數進行細胞計數，同時根據散射的數量和角度表征細胞大小、細胞核特征等對細胞進行分類。

圖2 流動式檢測方法

作為該領域的先驅，Grooth等人[56，61，62]利用光散射研究單細胞結構特征，用于區分淋巴細胞亞群以及從正常淋巴細胞中區分出毒性細胞，同時用于對白細胞進行3分群、5分類。后續光散射發展主要體現在兩方面：(1)多角度散射光分離技術[63，64]；(2)形態計量模型解釋散射模式[65，66]。

作為白細胞分類的一種有效手段，光散射可以收集到細胞大小、細胞顆粒度以及細胞質復雜性相關的信息，但仍無法準確獲取細胞核直徑等結構特征，也無法收集單細胞電學特征信息，所以光散射在單細胞分析領域應用有限。

3.3 光成像

光成像檢測單細胞結構特征的工作原理如圖2(c)所示[67]。在光成像方法中，細胞膜及細胞核染色的細胞流經檢測區域被不同波長激光照射，產生相應的不同發射熒光，利用成像元件(如CCD相機)捕獲對應的熒光圖像，表征細胞及細胞核的結構特征。

作為該領域的先驅，Luminex(Amnis)公司研究人員在流式細胞儀的基礎上發展了FlowSight成像流式細胞儀，后續針對激光種類、放大倍數以及靈活性等方面進行改進，形成了ImagingStream X Mark II成像流式細胞儀，可實現至多12通道光成像，廣泛應用于血液學、腫瘤學、干細胞分化等領域。

光成像廣泛應用于細胞形態學研究，能夠快速、準確地對細胞及亞細胞定位，提取細胞及細胞核的關鍵結構特征。相比于光散射，光成像能夠提供更準確、全面的細胞形態學分析，然而仍無法同時收集單細胞電學特征信息。

綜上所述，檢測單細胞結構和電學特征的流動式方法顯著提高了檢測通量，但著重在于獲取細胞結構特征，而沒有實現同時采集細胞固有電學特征的功能(電阻抗方法得到的電脈沖也僅反映了細胞大小的信息)，由于檢測參數的有限性限制了單細胞分析的應用。

4 基于微流控檢測方法

隨著微流控技術的發展，其特征尺寸可以很好地與細胞尺寸相匹配，能夠更方便、快速地用于細胞檢測，適用于高通量獲取細胞結構和電學特征參數。隨之發展的基于微流控檢測方法，驅動單個細胞依次通過檢測區域，引起阻抗信號的變化，依據等效模型，轉換為表征細胞結構和電學特征的參量。這類方法主要的發展，其一在于電極數量、結構布局等方面的改變，主要包括共面電極、對面電極、對面電極集成光學透鏡以及多電極結構；其二在于針對微通道的橫截面特征尺寸的改變，較于微通道結構(微通道橫截面積的特征尺寸大于細胞直徑)提出了壓縮通道(微通道橫截面積特征尺寸小于細胞直徑)的結構。

4.1 共面電極

作為基于微流控的方法檢測單細胞結構和電學特征的前驅，Gawad等人[68]提出了基于共面電極(電極處于同一平面)的微流控阻抗流式細胞儀，工作原理如圖3(a)所示。細胞在微通道中穿行，依次通過底部嵌入的3個共面電極，其中中間電極作為公共電極，與兩端電極分別組成一組電極對，構成差分阻抗檢測配置(細胞通過其中一組電極對時，另一組電極對作為參考，消除檢測噪聲等干擾)，測量細胞通過時的阻抗變化，反映細胞的結構特征和電學特征等信息。

Gawad等人[68]利用該結構，成功區分了不同粒徑的乳膠珠子(5 μm和8 μm)以及正常紅細胞與血影細胞(紅細胞經低滲處理后，質膜破裂將胞質內容物釋放至胞外后恢復原來形態和大小的細胞膜結構)。然而，該方法采用的共面電極在通道高度上產生電場分布不均勻，從而影響阻抗變化，更重要的是，由于缺乏有效模型的支撐，獲取的阻抗信號無法進一步轉化為細胞固有電學特征參數。

4.2 對面電極

針對通道高度上電場分布不均勻的問題，Cheung等人[69]提出了基于對面電極(電極面平行相對)的微流控阻抗流式細胞儀，工作原理如圖3(b)所示。細胞在微通道中穿行，依次通過兩對對面電極，其中底部電極共同接地，構成差分阻抗檢測配置，測量細胞通過時的阻抗變化，并提出“不透明度”(opacity)的概念，即高頻阻抗與低頻阻抗的比值，映射細胞結構和電學特征等信息。

圖3 基于微流控檢測方法

Cheung等人[69]利用該結構，成功區分了不同粒徑的乳膠珠子(4 μm， 5 μm和6 μm)、正常紅細胞與血影細胞、正常紅細胞與不同化學處理的紅細胞。該方法提出的對面電極結構，使得測量細胞周圍的電流密度更加均勻，一定程度上消除了電場分布不均對阻抗檢測的影響，但也增加了電極制備的復雜度，同時仍未解決表征單細胞結構和電學特征的根本問題。

4.3 對面電極集成光學透鏡

為了更好地表征單細胞結構和電學特征，增強檢測功能，Holmes等人[70]集成了對面電極與光學透鏡，形成了微流控阻抗熒光流式細胞儀，工作原理如圖3(c)所示。細胞在微通道中穿行，通過兩對對面電極，采集差分阻抗信號變化，同時細胞內熒光抗體被激光照射激發，產生相應的發射熒光信號被光電器件(光電倍增管PMT)接收，從而實現細胞結構和電學特征的多維表征。

Holmes等人[70]利用該裝置，結合阻抗信號和熒光信號，實現了白細胞3分群[70]或淋巴細胞亞群分類[71]，相較于上述微流控方法，該方法增加了維度參數，有利于更全面地理解單細胞結構和電學特征，但同樣無法獲取單細胞固有的電學特征。

4.4 多電極

近年來，該領域研究人員通過增加電極個數、改變電極布局等，消除現有方法存在的細胞位置影響測量結果的問題。Caselli等人[72–74]一直致力于此，首先提出了一種新型共面5電極結構[72]，工作原理如圖4(a)所示。細胞在微通道中穿行，依次通過底部的5個電極，其中在第3電極上施加交流信號，第2和第4電極處于浮動，第1和第5電極測量流經的電流差。該結構中的電極布局形成的非均勻電場，包括4個高場強區域和之間間隔的弱場區域，從而形成的信號趨勢與細胞大小及所處垂直位置相關，并可用于補償細胞垂直位置變化引起的細胞尺寸測量的誤差，從而達到高精度表征細胞結構特征，但該方法只能得到阻抗數據，無法得到細胞固有電學特征。

后續，Reale等人[73]在上述共面5電極的基礎上，增加了兩對相對共面電極用于表征單細胞結構和電學特征，結構示意如圖4(b)所示。兩對相對共面電極位于側通道底部，將交流電壓施加在其中一組對角電極，另一組對角電極收集差分電流，用于測量細胞橫向位置；5個共面電極位于主通道底部，檢測配置同上，用于測量細胞垂直位置。通過確定細胞在通道中橫截面位置，消除位置對細胞尺寸測量的影響，但同樣無法獲取固有電學特征。

另一方面，Honrado等人[74]在保留兩對相對共面電極的基礎上，將共面5電極更改為兩對對面電極，結構示意如圖4(c)所示。相對共面電極的檢測配置同上，而對面電極檢測配置同樣更改為對角激勵及檢測。該方法同樣用于確定細胞在通道中的橫截面位置，更準確地獲取細胞結構特征，但仍不能得到細胞固有電學特征信息。

Yang等人[75]針對電極布局進行改進，提出了一種新型N型電極結構，用于表征單細胞結構和電學特征，結構示意如圖4(d)所示。N型電極由兩個外側電極和中間一個傾斜電極組成。由于傾斜電極的設計，不同橫向位置細胞通過前端兩個電極和后端兩個電極的時間不同，從而精確細胞的橫向位置，校準細胞的結構特征。相對于Caselli等人[72]的新型共面5電極結構，該結構電極相對更簡單，獲取的信號波形更易于處理，但仍無法將阻抗數據轉換為細胞固有電學特征。

圖4 基于微流控檢測方法(多電極)

與此同時，Spencer等人[76]對此也做了一些工作，提出了一種對面5電極結構，結構示意如圖4(e)所示。其中第2和第4電極對，頂部電極施加多種頻率電壓激勵，底部電極用于收集差分電流，其余電極接地。獲取的阻抗頻譜通過單殼模型(即假設一個一定厚度的球形殼體將內部相與環境相分離)進一步處理校準，可得到細胞結構和電學特征，如細胞大小、細胞膜比電容、細胞質電導率和介電常數。然而由于模型中的某些參量非實際檢測確定的，而是依據前人數據進行假設設定的，同時又由于細胞與通道壁之間存在較大的間隙，導致細胞通過時阻抗變化較低，無法精確獲取細胞結構和電學特征。

近來，文獻[77]觀察到非對稱細胞產生的阻抗脈沖存在傾斜的現象，為了進一步表征細胞的形狀，提出了一種新型電極布局結構，其工作原理如圖4(f)所示。在該結構中，使用一個非平行浮動電極來分離共面3電極形成的兩個檢測區域，同時浮動電極間形成等電場區域，細胞通過時，阻抗保持不變。依據細胞通過時間來確定細胞的橫向位置校準細胞大小，同時通過得到的阻抗信號傾斜指數作為細胞形態表型。該方法提供了更多細胞結構特征的信息，但仍未獲取細胞固有電學特征參數。

綜上所述，以上單細胞結構和電學特征的微流控檢測方法更多地在于通過獲取細胞在微通道橫截面中位置，以此來校準細胞尺寸，進一步修正阻抗信號，但缺乏有效的模型將阻抗數據進一步轉化為細胞固有電學特征。

4.5 壓縮通道

針對上述方法，細胞在微通道中穿行，與通道內壁存在很大的間隙，總體來說，很難提出有效的等效電學模型獲取細胞固有電學特征，如細胞膜比電容和細胞質電導率。所以對此，本課題組減小微通道的橫截面積，提出了壓縮通道的概念。

本課題首先提出了基于“一字型”壓縮通道的微流控阻抗流式細胞儀，工作原理如圖5(a)所示[78]。細胞連續通過壓縮通道，利用鎖相放大器檢測壓縮通道兩端雙頻阻抗信號，同時利用高速照相機記錄細胞通過壓縮通道的形態(如細胞拉伸長度，即細胞被壓縮后在穿行方向上的長度)。然后依據該方法提出的壓縮通道等效電學模型進行轉換擬合得到單細胞膜比電容、細胞質電導率以及細胞直徑。然而，該方法由于圖像采集處理過程得到數據用于后續計算，限制了檢測通量，無法獲取具有統計學意義的大量數據。

為了進一步提高檢測通量，本課題組提出了基于“十字型”壓縮通道的微流控阻抗流式細胞儀，工作原理如圖5(b)所示[79]。細胞通過“十字型”主壓縮通道的同時，利用鎖相放大器測量側壓縮通道兩端之間的雙頻阻抗信號，基于提出的等效電學模型轉換擬合得到單細胞膜比電容和細胞質電導率。該方法雖然極大地提高了檢測通量，但缺少了單細胞結構特征檢測。

針對“一字型”和“十字型”壓縮通道的限制，本課題后續提出了基于“雙T型”壓縮通道的微流控阻抗流式細胞儀，工作原理如圖5(c)所示[80]。細胞通過雙T型壓縮通道時，利用鎖相放大器測量側通道兩端之間的雙頻阻抗信號，根據阻抗信號波形與細胞穿行距離進行匹配得到細胞拉伸長度，進一步得到細胞直徑，同時阻抗幅值、相位擬合于等效電學模型可得到單細胞膜比電容和細胞質電導率。該方法在滿足高通量的條件下，盡可能更多地檢測單細胞結構和電學特征參數，但針對細胞核的結構和電學特征仍未表征。

圖5 基于微流控檢測方法(“壓縮通道”)

為了進一步提高檢測參數，本課題組最新開展了具有熒光檢測窗口的“雙T型”壓縮通道的微流控流式細胞儀?！半pT型”壓縮通道結構用于進行阻抗檢測，得到細胞直徑、細胞膜比電容和細胞質電導率；同時熒光檢測窗口用于進行熒光檢測，得到細胞核直徑。該方法可以在保證一定的高通量前提下，獲取單細胞相對完整的結構和電學特征，但針對細胞核形態不規則(如桿狀或分葉狀)，該方法仍無法做出表征，同時也無法獲取細胞核的電學特征等，但這也給后續的研究提供了方向。

以上，就目前已有的單細胞結構和電學特征檢測方法進行了闡述概括，主要介紹了不同檢測方法的原理、發展及主要優缺點，并提出了目前該領域所面臨的機遇挑戰。最后，針對單細胞結構和電學特征檢測方法主要的標志性發展及檢測參數和成就，歸納總結如表1所示，有望對后續單細胞結構 和電學特征檢測方法的發展有一定指導意義。

表1 單細胞結構和電學特征檢測方法標志性發展

5 結束語

單細胞結構和電學特征檢測揭示了細胞之間的差異，能夠更好地應用于分析血液細胞生理病理機制、腫瘤細胞惡性程度以及干細胞分化階段。面對單細胞固有結構和電學特性應用的需求越來越多，基于微流控技術的檢測方法在迎接更多的挑戰的同時也面臨一些潛在方向的機遇。其中提升檢測通量是一大方向，隨著檢測通量的提高，大量具有統計學意義的數據的獲取對于分析更多樣本(如血液中痕量存在的循環腫瘤細胞的分析)以及分析的準確性都有巨大意義。另一潛在方向在于檢測參數的增加及綜合檢測的實現，隨著更多解耦參數的應用十分有利于細胞亞類型的分類(如白細胞5分類以及粒細胞系統劃分為早幼、中幼、晚幼、桿狀核和分葉核粒細胞等)?？偠灾?，基于微流控的單細胞結構和電學特征檢測方法仍處于探索、發展階段，還需要進一步的技術創新，高通量地實現單細胞結構和電學特征多參數表征以對單細胞進行綜合評估。