互助縣牦牛呼吸道疾病病原的分離鑒定

殷 林

青海省海東市互助縣畜牧獸醫(yī)站，青海海東 810500

近年隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖數(shù)量大幅度的增加，牛病的發(fā)生也越來越多且越來越復雜[1]。其中牛呼吸道疾病綜合征由多種病原所引起，包括BPIV-3、IBRV、BVDV或化膿性隱秘桿菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌等其他細菌所引起的一種會使牛發(fā)生一系列呼吸道反應的疾病。患有呼吸道疾病的病牛在臨床上會顯示出肺部的感染，尤其是病毒對呼吸系統(tǒng)會造成很大的傷害，引起呼吸系統(tǒng)疾病。感染病毒后會出現(xiàn)呼吸困難，并且有一定程度的呼吸障礙，吃食無力等癥狀。牛在排泄時會觀察到糞便不成型、水樣便，最終牛會出現(xiàn)四肢無力的癥狀，嚴重者會導致死亡。急性感染的情況下，發(fā)病時間短，并且在15 d內(nèi)快速的死亡，剖檢急性感染死亡的病牛會出現(xiàn)肺臟腫大、肺臟與胸膜黏連、胸腔積液的癥狀，并且有一部分發(fā)病嚴重的病死牛會出現(xiàn)肺臟纖維化，出現(xiàn)白色泡沫的癥狀。該類疾病主要引起牛高熱、精神不佳、呼吸困難、流鼻涕、咳嗽等癥狀，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[2，3]。本試驗通過對互助縣某牛場暴發(fā)的牦牛呼吸道疾病綜合征進行PCR鑒定，確定牦牛感染的病原體，更好的為牛病的防控奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 病料

2021年1月，青海互助縣某牦牛養(yǎng)殖場內(nèi)最近出現(xiàn)部分牦牛有高熱、消瘦、咳嗽、呼吸障礙等癥狀，選取6頭呼吸道癥狀明顯的牦牛采取其鼻液進行試驗。

1.2 采樣

用無菌鼻拭子采集6頭牛的鼻液，并于鼻拭子采樣器中添加細胞保持液。將樣本做好標記，分別標 記 為HZ-1，HZ-2，HZ-3，HZ-4，HZ-5，HZ-6。保存于4 ℃環(huán)境內(nèi)盡快進行檢測。

1.3 試驗材料

1 000 μL吸頭、200 μL吸頭、10 μL吸頭、無菌離心管1.5 mL、無RNA酶離心管1.5 mL、天根鼻拭子DNA提取試劑盒、天根鼻拭子RNA提取試劑盒，life反轉(zhuǎn)率試劑盒，Ex-Tap Mix購自大連寶生物。

1.4 引物合成

BPIV-3、IBRV、BVDV、化膿性隱秘桿菌、多殺巴氏桿菌的引物參照吳翠蘭發(fā)表的文章[4]，由華大基因公司進行合成。

1.5 病料的PCR鑒定

RNA/DNA樣本提取根據(jù)天根提取試劑盒說明書進行操作，RNA樣本要使用life反轉(zhuǎn)率試劑盒將cDNA轉(zhuǎn)錄為DNA，PCR程序按照吳翠蘭等發(fā)表的文章[4]進行設置，PCR體系為50 μL，反應體系如表1。反應結(jié)束后進行1.5的瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠電泳成像儀下觀察試驗結(jié)果。

表1 PCR反應表

2 結(jié)果

進行PCR試驗后結(jié)果顯示檢測BPIV-3、IBRV均為陰性，檢測BVDV結(jié)果顯示HZ-2，HZ-3，HZ-4，HZ-5為陽性，化膿性隱秘桿菌檢測結(jié)果顯示HZ-2，HZ-3，HZ-4，HZ-5為陽性，HZ-1，HZ-6均為陰性。

3 討論

牛呼吸道疾病綜合征對養(yǎng)牛業(yè)影響十分巨大，嚴重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，我國不同地區(qū)均有牛呼吸道疾病綜合征的發(fā)生。2014年郭利等[5]建立了牛呼吸道疾病綜合征相多重PCR檢測方法，可以同時進行BVDV、BPIV3、IBRV和BRSV四種病毒的檢測，并對四個省份的樣本進行了檢測，檢測結(jié)果顯示多為多重病毒感染。2017年曹禺[6]等對內(nèi)蒙古某地區(qū)的牛呼吸系統(tǒng)疾病進行了分離和鑒定，結(jié)果顯示主要引起呼吸道疾病的病原為牛呼吸道合胞體病毒和支原體。2019年張穎慧等[7]對四川省11個暴發(fā)牛呼吸道綜合征的肉牛場進行了多病原的檢測，檢測結(jié)果顯示共檢測出9種病原，以IBRV、牛分支桿菌和溶血性曼氏桿菌較為多見，且較多呈混合感染。2020年6月至2021年1月，孫凌煒[8]對我國北方部分地區(qū)和牧場進行樣本收集，進行了引起牛呼吸道綜合征主要病原流行病學調(diào)查，結(jié)果顯示檢測到多種不同的病原，各種病原檢測陽性率在0.75%～19%之間，且存在不同種病原的混合感染。本試驗的結(jié)果顯示互助縣某牦牛養(yǎng)殖場檢測的樣本中含有BVDV和化膿性隱秘桿菌，6例樣本中有4例含BVDV，4例含化膿性隱秘桿菌,且均為混合感染，其他2例為陰性樣本，本次檢測未檢測到BPIV-3、IBRV、多殺巴氏桿菌，對于互助縣牦牛呼吸道疾病仍需要加強監(jiān)控。

近年，我國奶牛和肉牛發(fā)展非常迅速，牦牛養(yǎng)殖業(yè)也不斷地擴大，且隨著國家對于西北經(jīng)濟發(fā)展的大力支持和重視，西北地區(qū)的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展得到了很高的提升。牛呼吸道綜合征對養(yǎng)殖業(yè)的影響十分嚴重，造成了很大的經(jīng)濟損失，且多以混合感染為主，治療難度大。隨著畜牧獸醫(yī)科技發(fā)展，對于多種病原的檢測可采取多重PCR，real-timePCR等先進的技術(shù)手段進行檢查[9]，更快更精準的了解病原，為牛呼吸道綜合征的有效防控提供依據(jù)。我國動物防疫一直采取“預防為主”的政策，政府對于重大的動物疫病進行強制免疫，有效的控制了很多動物疾病的發(fā)生。我國對于牛呼吸道綜合征的研究已經(jīng)十分廣泛，了解牛呼吸道綜合征的病原可以更好的進行疾病防控，對于疾病的防控有了很大的幫助，預防疾病要進行有針對性的疫苗防控，幫助建立特異性的免疫力，雖然我國對于該類疾病的研究已經(jīng)有了很大的進步，但是也相對于國外有所差距，在這方面的研究，我國獸醫(yī)科研人員仍需加大努力，更好的為養(yǎng)殖業(yè)服務。

此外，豐富農(nóng)牧民對高原牦牛呼吸系統(tǒng)疾病的認知，加強健康宣教，使農(nóng)牧民充分了解呼吸系統(tǒng)疾病對高原牦牛健康及養(yǎng)殖業(yè)造成的危害，能夠充分認識加強呼吸系統(tǒng)疾病防治工作的重要性和必要性。相關(guān)部門應該加大對牦牛呼吸系統(tǒng)疾病的宣傳力度，可通過建立宣傳網(wǎng)站、短信發(fā)送、微信推送、廣播及視頻等形式，豐富廣大農(nóng)牧民對呼吸系統(tǒng)疾病病理知識、危害以及防治措施等知識的認知，激發(fā)和調(diào)動廣大農(nóng)牧民的疾病預防積極性和主動性。

4 小結(jié)

牦牛為高原地區(qū)農(nóng)牧民常見養(yǎng)殖牲畜，對于提高農(nóng)牧民經(jīng)濟收入以及推動高原地區(qū)畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展均可發(fā)揮非常重要的作用。高原地區(qū)溫度較低且氣候多變，雖然牦牛具有較強的御寒能力，但是溫度突變?nèi)菀自斐申笈．a(chǎn)生應激反應并誘發(fā)感冒等常見呼吸系統(tǒng)疾病，對牦牛的健康生長發(fā)育等均會造成不良影響。為了提高牦牛的生產(chǎn)效率及廣大農(nóng)牧民的經(jīng)濟效益，必須采取科學合理的防治措施以有效控制呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展。此外，互助地區(qū)某牦牛養(yǎng)殖場感染的牛呼吸道綜合征主要以BVDV和化膿性隱秘感染混合感染為主，需要養(yǎng)殖場加強免疫管理，且對于細菌性疾病要精準用藥，避免出現(xiàn)耐藥性，在臨床中要進行合理的用藥，相信通過大家科學的飼養(yǎng)，高效的疾病防控能力，可以更好地增加經(jīng)濟效益，為互助縣的牦牛養(yǎng)殖業(yè)做出貢獻。